學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；
（2） 掌握使用水平式電泳儀的方法；
（3）掌握核酸瓊脂糖凝膠電泳的基本操作
2實驗原理
瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質太大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用于核酸的研究中。
核酸是兩性電解質，其等電點為pH2-2.5，在常規的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：
1
DNA的分子大小。
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。
2
DNA分子的構象。
當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋質粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。
3
電源電壓。
在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。
4
離子強度影響。
電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
溴化乙啶能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。
常規的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因為變性后的RNA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發生高效雜交。
3儀器及試劑
1.儀器及耗材:
水平電泳槽,電泳儀,凝膠成像分析系統,微波爐,微量移液器,透明膠帶,點樣或parafilm,100 ml或250 ml錐形瓶,量筒,吸頭等.
2.試劑及配制:
50×TAE緩沖液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)
配制1000 ml
Tris 242 g
冰乙酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
加入600 ml去離子水后攪拌溶解,將溶液定容至1 L后.高溫高壓滅菌,室溫保存.
1×TAE緩沖液的配制:
稱量20 ml的50×TAE緩沖液,再加入980 ml的去離子水.
溴化乙啶貯存液:10 mg/ml 溴化乙啶
配制:100 ml
稱取1 g溴化乙啶,置于100 ml燒杯中,加入80 ml去離子水后攪拌溶解.將溶液定容至100 ml后,轉移到棕色瓶中.室溫保存.
6×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍,0.25%二甲苯青FF,30%甘油.
配制:10 ml
溴酚藍 25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE緩沖液定溶至10 ml,分裝成1 ml/管.-20℃保存.
其它試劑:DNA樣品,DNA Ladder ,瓊脂糖,
4操作步驟
1
制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml):稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,搖勻,即成1.0%瓊脂糖凝膠液.
2
膠板制備:取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好,形成模子.將內槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層.室溫下靜置直至凝膠完全凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中.添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止.
3
加樣:在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X.用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內,每加完一個樣品,應更換一個加樣頭,以防污染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面.
4
電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳,電壓60-100V,樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動.電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低.當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳。
5
電泳完畢后,取出凝膠,用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE溶液染色約20 min,再用清水漂洗10 min。
6
觀察照相:在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統拍照保存。
5常見問題及注意事項
（1）配瓊脂糖時應使其完全熔化后方可制膠.
（2）瓊脂糖凝膠易于破碎,操作時要輕緩.
（3）電泳時應注意電源線路,預防觸電.
（4）溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用時應帶乳膠或一次性塑料手套.并在專門的實驗室內使用.
（5）紫外線對人體有損傷作用,開燈時間不宜太長,注意防護.
（6）DNA帶形狀模糊:DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡.
（7）質粒DNA的存在形式有3種,①共價閉環DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在；②開環DNA(ocDNA),此種質粒DNA的兩條鏈中有一條發生一處或多處斷裂,因此可以自由旋轉從而消除張力,形成松弛的環狀分子；③線狀DNA,因質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.因此質粒DNA電泳的結果中有可能出現三條泳帶,它們的泳動速度為:cccDNA > 線狀DNA > ocDNA.