從哺乳動物細胞、酵母或細菌分離的染色體 D
NA 在瓊脂糖栓中可用所需的內切酶消化。低熔點瓊脂糖栓的孔足以使內切酶進入，與作為底物的基因組 DNA 相作用。消化后，經 PFGE 分離，然后回收或做 Southern 印跡分析。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 從哺乳動物細胞、酵母或細菌分離的染色體 DNA 在瓊脂糖栓中可用所需的內切酶消化。低熔點瓊脂糖栓的孔足以使內切酶進入，與作為底物的基因組 DNA 相作用。消化后，經 PFGE 分離，然后回收或做 Southern 印跡分析。 |
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| 實驗材料 | 限制酶基因組 DNA |
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| 試劑、試劑盒 | 限制酶緩沖液TE |
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| 儀器、耗材 | 脈沖場電泳用的凝膠水浴 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
1X 限制酶緩沖液
TE ( pH 7.6)
2. 酶和緩沖液
限制酶
3. 凝膠
脈沖場電泳用的凝膠
4. 核酸和寡核苷酸
包埋在低熔點瓊脂糖栓中的基因組 DNA
5. 專用設備
設定在酶切最佳溫度的水浴
二、方法
1. 如果凝膠栓未在 TE 中存放（如通過郵寄收到的凝膠栓或一直存放在 0.5 mol/L EDTA 中的），則在 50 倍體積 TE ( pH 7.6) 室溫溫育 30 min。轉移凝膠栓至新的 50 倍體積 TE ( pH 7.6) 室溫溫育第二個 30 min。否則直接進行步驟 2。
2. 將凝膠栓移入微離心管，每管加入 10 倍體積相應的 1X 限制酶緩沖液。室溫溫育 30 min。
3. 除去緩沖液，用 2~3 倍體積新鮮 1X 限制酶緩沖液替代它。每管加入 20~30 單位相應限制酶該酶作用的最佳溫度溫育；如果是 YAC DNA 溫育 3 h, 哺乳動物 DNA 溫育 5~6 h。
4. 如果 DNA 只用一種酶消化，消化后將凝膠栓浸入 4℃ 20 倍體積的 TE ( pH 7.6) 內。1 h 后按步驟 7 處理。如果 DNA 用一種以上的酶消化，則跳過 TE 溫育而進行步驟 5。
5. 如果 DNA 用一種以上的酶消化，加入第二種酶之前再次用相應緩沖液平衡凝膠栓。為了充分平衡，使用自動移液器從每管盡可能多的除去第一個酶的緩沖液，并用 1 ml TE 替代它。除去 TE, 加入新鮮的 1 ml TE。室溫存放 30~60 min。輕輕除去 TE。
6. 每管加 10 倍體積第二個 1x 限制酶緩沖液，室溫溫育 30 min。如步驟 3 描述的進行限制酶消化。最后，每個凝膠栓浸入 4℃ 20 倍體積的 TE (pH 7.6) 內 1 h。
7. 用一次性移液器吸頭將凝膠栓直接輕輕推入脈沖場凝膠的加樣孔（槽）中，電泳分離 DNA 片段。 |
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