實驗方法原理 溫度高時瓊脂呈液態，但在37℃ 時成凝膠狀態，細胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養基中，待瓊脂形成凝膠后進行培養，形成散在集落，很容易分離。
實驗材料 Noble瓊脂Difco胎牛血清
儀器、耗材 兩倍濃度培養基生長培養基無菌超純水無菌錐形瓶吸管通用容器培養皿水浴三角瓶托盤電子細胞計數儀本生煤氣噴燈
實驗步驟
1. 在培養皿底皿側面編號或做好標記，將培養皿放在托盤中，很方便。
2. 準備含 40 % FBS 的 2× 培養基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養基配 2× 培養基，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清），保持 37℃。
3. 稱取 1.2 g 瓊脂。
4. 分別在無菌錐形瓶和另一個無菌瓶中加 100 ml 無菌 UPW。將 1.2 g 瓊脂放人錐形瓶中，蓋好，煮沸 2 min 。另一種方法是，提前高溫滅菌瓊脂。但若已保存起來，使用時仍需煮沸溶解或微波爐融化備用。
5. 將煮沸過的瓊脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。
6. 2× 培養基和 1.2 % 瓊脂等量混合制備 0.6 % 瓊脂底層，保持 37°C 。如果需要任何的生長因子、激素或其他添加物，應在此時添加至底層瓊脂培養基（生長培養基，1×，用于細胞稀釋）內。
7. 在培養皿中加人 1 ml 0.6 % 的瓊脂培養基，晃勻，確保培養基覆蓋整個培養皿底。置于室溫定型。
8. 制備細胞懸液，計數。
9. 準備 0.3% 瓊脂培養基，保持 37°C 。此培養基可以用 37°C 的 2× 培養基、55°C 的 1.2 % 瓊脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制備。
10. 制備以下稀釋濃度的細胞，使細胞的最大濃度為 1×105 /ml。
(a)1×105 /ml
(b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml
(c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml
(d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml
11. 將四種稀釋液的濃度分別標在 4 個小玻璃瓶或試管上，從每種稀釋液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 細胞液，分別放入相應容器內 37°C 加 4 ml 0.3% 瓊脂培養基，混勻，再從每個容器（通用容器，小玻璃瓶或離心管，稀釋細胞用）中吸出 3 個 1 ml 分別加在相應的三個培養皿上。最終濃度如下：
(a)1×103 /ml/皿
(b)330 /ml/皿
(c)110 /ml/皿
(d)37 /ml/皿
加細胞之前， 確保上層瓊脂培養基有足夠的時間冷卻至 37°C 。
12. 待培養皿中的溶液在室溫下形成凝膠狀態。
13. 將培養皿放置在一個帶蓋的清潔塑料盒中，37°C 加濕溫箱中培養 10 天。
注意事項
準備培養基和細胞之前，先算出細胞稀釋度，在培養皿上做好標記，檢測一個細胞系的克隆形成率時，為每種稀釋度的細胞分別準備3 個培養皿。每個3. 5 cm 培養皿適宜接種的細胞數是1000、333、111和 37 個。也就是依次 3 倍的稀釋細胞懸液。如果需要加入生長因子、激素或其他添加劑，應加在下層的 0.6 % 瓊脂中。
其他
如果需要測定生長因子的活性滴度或選擇不同因子，在鋪底層瓊脂之前向培養皿內加入所需量的因子。