液相色譜儀液體樣品預處理技術固相萃取儀器結構、操作

自1970年發明固相萃取技術以來,其發展非常迅猛,出現了多種形式的萃取裝置,包括SPE柱(SPE cartridge)、尖形SPE管(SPE pipette tip)、SPE盤(SPE disk)以及SPE板(SPE plate)等。

SPE柱(如圖1所示)的使用最為普遍,簡單的SPE柱就是一根直徑為數毫米的小玻璃柱,或用聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料或不銹鋼制成的柱子。柱下端有一孔徑為20μm的燒結篩板,用以支撐吸附劑。在篩板上填裝一定量的吸附劑,然后在吸附劑上再加一塊篩板,以防止加樣品時破壞柱床。基于對純度的考慮,一般選用無添加劑且含有微量雜質的醫用聚丙烯作為柱體材料,以免在萃取過程中污染試樣。為了降低SPE空白中的雜質,可選用玻璃、純聚四氟乙烯作為柱體材料。篩板材料是另一可能的雜質來源,制作篩板的材料有聚丙烯、純聚四氟乙烯、不銹鋼和鈦等。金屬篩板不含有機雜質,但易受酸的腐蝕。由于柱體、篩板和填料都可能向試樣中引進雜質,因此在建立和驗證SPE方法時,必須做空白萃取實驗。

SPE的另一種形式是SPE盤(如圖2所示),外觀上與膜過濾器十分相似。盤式萃取器是含有填料的純聚四氟乙烯圓片,或載有填料的玻璃纖維片。填料占SPE盤總量的60%～90%,盤的厚度約1mm。SPE柱和盤式萃取器的主要區別在于床厚度與直徑之比,對于等重的填料,盤式萃取的截面積比柱式萃取大10倍左右,因而允許液體樣品以較高的流量流過。

當所需處理的樣品量較大時,如醫藥中間體的回收等,可采用板式SPE的固相萃取裝置。圖3給出了SPE板的結構,上下兩塊板上裝有多個SPE小柱,待處理的液體依靠重力、壓力、真空或離心力的作用通過萃取板,同時在收集板上進行樣品的收集。典型的固相萃取一般分為以下五個基本步驟:

①根據檢測量的大小以及待檢物質的化學、物理性質,選擇合適的吸附柱。

②活化填料。有利于吸附劑和目標物質相互作用,提高回收率。一般采用甲醇來活化,另外甲醇還能起到除雜的作用。每一活化溶劑的用量為(1～2)m/100mg固定相。

③進樣。使樣品流經吸附柱并被吸附。為了保留分析物,盡可能使用最弱的樣品溶劑,并允許采用大體積(0.5～1L)的上樣量。 

④沖洗。用水或者是適當的緩沖溶液對吸附柱進行沖洗,將雜質沖洗掉。通常沖洗溶劑體積為0.5～0.8ml/100mg固定相。⑤洗脫。選擇適當的洗脫劑進行洗脫,收集洗脫液,然后進行濃縮、檢驗,或者是直接進行在線檢測。洗脫溶劑用量一般為0.5～0.8ml/100mg固定相。

圖1 SPE柱裝置示意圖

圖2 SPE盤

圖3 SPE板簡圖

固相萃取(solid phase extraction,SPE)是一下種由柱色譜發展而來的樣品預處理技術,所用的填料粒徑(>40μm)大于HPLC填料粒徑(3～10μm)。SPE與HPLC的差別是柱壓低、塔板數少、分離效率較低、一次性使用,因此只能分離保留性質有很大差別的化合物。由于SPE實現了選擇性的提取、分離、濃縮三位一體的過程,操作時間短、樣品量小、干擾物質少,因此可用于揮發性和非揮發性組分的預處理,并具有很好的重現性。

吸附劑是固相萃取的核心,吸附劑選用的好壞直接關系到能否實現萃取操作,以及萃取效率,同時新型吸附劑的研發也是固相萃取技術發展和應用的關鍵所在。早期的吸附劑多為活性炭、氧化鋁等強吸附性材料。常用的固相吸附材料有正相、反相和離子交換吸附劑三種正相吸附劑主要包括硅酸鎂、氨基、氰基、雙醇基硅膠、氧化鋁等,適用于極性化合物的萃取;反相吸附劑包括鍵合硅膠C₁₈、鍵合硅膠C₈、芳環氰基等,適用于非極性至一定極性化合物的萃取;離子交換吸附劑包括強陽離子吸附劑(苯磺酸、丙磺酸、丁磺酸等)和強陰離子吸附劑(三甲基丙基胺、氨基、二乙基丙基胺等),適用于陰陽離子型有機物的萃取。目前國內外已經研制出多種復合型吸附劑。聚合二乙烯苯-N-乙烯吡咯烷酮及其鹽是一類性能獨特的反相吸附劑,獨有的親水和親脂性質保持其在水中濕潤,能同時萃取極性物質和非極性物質。以氯甲基化的高分子樹脂PS-DVB(苯乙烯-聯苯乙烯共聚物)與二亞乙基三胺反應制成的新型的陰離子交換聚合樹脂能同時萃取離子型和非離子型化合物;將碳化吸附劑與PS-DVB合用,能同時萃取強極性化合物和離子型化合物;將未封尾的C₁₈硅膠與單官能團的C₁₈硅膠混合,可以擴大C18柱的極性范圍。

免疫親和型吸附劑是基于抗體抗原相互作用的原理而研制出來的新型固相吸附劑。首先備一種專屬性的抗體,然后將其固定在瓊脂糖或硅膠上,當樣品通過吸附床層時發生抗原-抗體結合,從而專屬性地將目標組分分離出來。這種吸附劑是目前已知選擇性最強的固定吸附劑。近年來,這種吸附劑越來越多地被應用于醫學、生物學以及環境分析等領域。分子印跡型吸附劑是一類新型的高選擇性吸附劑,能從復雜的生物基質中選擇性地提取出微量分析物。表1中給出了常用的SPE固定相及應用條件。

表1 SPE固定相及應用條件

在固相萃取中,選擇洗脫劑時首先應考慮其對固定相的適應性和對目標物質的溶解度,其次是傳質速率的快慢。洗脫正相吸附劑吸附的目標組分時,一般選用非極性有機溶劑(如正己烷、四氯化碳等);洗脫反相吸附劑吸附的目標物質時,一般選用極性有機溶劑(如甲醇、乙腈、一氯甲烷等);對于離子交換吸附劑,常采用的洗脫劑是高離子強度的緩沖液。 

為了提高回收率,洗脫劑多選用小分子有機溶劑,同時增大洗脫劑用量。這樣可使吸附劑上的目標組分盡可能地被洗脫下來,但同時可能會引進一些雜質,給分析帶來干擾。值得注意的是,以甲醇為洗脫劑洗脫樹脂時,如果甲醇體積過大,則會引起樹脂的充分溶脹,目標物質深入到樹脂的內部間隙,很難再被洗脫,導致洗脫不完全,回收率降低。

在固相萃取過程中,應當注意以下影響因素。 

①吸附劑的選擇:實驗時盡量選擇與目標化合物極性相似的吸附劑,其用量大小與目標物性質(極性、揮發性)及其在水樣中的濃度直接相關;吸附劑最好是多孔、比表面積大的固體顆粒,表面積越大,吸附能力越強,但是相應孔徑會減小,應根據實際情況綜合考慮;吸附劑必須具有較小的空白值,以減少吸附劑引起的污染和干擾;萃取吸附過程必須可逆并且具有較高的回收率,吸附劑必須能夠快速地吸附分析物,并且能夠在適當的溶劑條件下快速釋放分析物,同時具有恒定的回收率,保證整個分析結果更加可靠、準確;吸附劑必須要具有很好的化學穩定性,具有較強的耐酸堿腐蝕能力,在各種淋洗劑條件下不會發生溶脹作用;吸附劑必須與樣品溶液表面有很好的界面接觸,只有樣品與吸附劑表面充分接觸才能夠保證定量萃取。

②溶劑的選擇:在固相萃取中,萃取固定相的活化、上樣富集、淋洗雜質、分析物洗脫的過程中,都涉及溶劑的選擇問題。溶劑選擇最重要的是溶劑強度,這是保證固相萃取成功的關鍵表2給出了常見正相型和反相型固相萃取中有機溶劑的極性和強度大小關系。

表2 正相型和反相型固相萃取中常用溶劑的性質

對于固定相活化溶劑,一般先使用強的溶劑去除固定相上的雜質,然后選擇與上樣溶劑強度一致的活化溶劑,以保證樣品能夠在固定相上充分保留。需注意的是,固定相在活化過程和活化結束后都要保持濕潤,否則會使固定相干裂或者進入氣泡,導致柱效降低、回收率降低以及重現性變差。

對于上樣溶劑的選擇,要盡可能選擇弱強度的溶劑,保證樣品能夠充分地保留在固相萃取柱上,還可以采用大量上樣方法,提高富集倍數。如果上樣溶劑強度過高,樣品不能保留或者弱保留,則回收率低。

對于洗脫溶劑,要選擇溶劑強度比較大的,保證保留在固定相上的樣品洗脫下來,對大多數化合物來說,乙腈是一種比甲醇和乙醇更好的洗脫溶劑。另外,選擇的洗脫溶劑要與后續的分析條件相適應。還有就是要選擇黏度小、純度高、毒性小并且不與樣品和固定相發生反應以及不會干擾樣品后續檢測的溶劑。如果單一的洗脫溶劑效果不理想,也可考慮使用混合溶劑進行洗脫。

③固定相容量:在上樣過程中,要注意樣品的含量不要超過萃取柱容量,如果超過萃取柱容量,過量的樣品不會在萃取柱上保留而丟失,導致回收率下降。

④流速控制:流速的控制對固相萃取至關重要,流速過大將引起萃取柱的穿漏,流速小則處理速度太慢。萃取柱預處理過程中流速適中,保證溶液充分濕潤吸附劑即可,上樣和洗脫過程則要求流速盡量慢些,以使分析物盡量保留在柱內或達完全洗脫,否則會導致分析物流失,影響回收率的大小。尤其是離子交換過程進行比較緩慢,應采用較低的流速(0.5～2.0ml/min)。