第二部分 細胞因子
細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測
一、簡介
隨著研究的進展，僅僅對細胞進行定量和活性的檢測已不能滿足需要。在單細胞水平研究細胞因子的表達能力對研究細胞因子在疾病中的作用越來越顯的重要無比。目前檢測單個細胞特定細胞因子的表達手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細胞化學、限制性稀釋分析（limiting
dilution
analysis，LDA）和單細胞PCR，應用原位雜交技術和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRNA表達可以識別Th1和Th2細胞，此方法可獲得較強的細胞內信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細胞PCR技術，技術性強、勞動強度大，難以進行廣泛推廣。隨著多標記及胞內細胞因子標記流式細胞技術的出現，使對細胞內細胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主要對胞內細胞因子流式細胞技術作以介紹。
早期細胞因子表達與細胞功能相關性研究是基于特定克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－?)與TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但這些研究很難外推，因為T細胞克隆與體內T細胞功能相關性還未被揭示。
近來，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內高爾基體介導的轉運的方法使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。因為自然狀態下，T淋巴細胞產生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細胞產生的細胞因子已釋放出來，胞內細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這一方法可檢測單個細胞內多個細胞因子，并可區分表達特定細胞因子的細胞亞群。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞(T、B、NK)不能分泌細胞因子。
胞內流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優點：
? 快速：流式定量檢測細胞內細胞因子可在一天內完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便；
? 簡便：無需組織培養，可以全血分析，無需分離PBMCs；
? 靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統；
? 高效：可以在同一個細胞內同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據細胞免疫表型區分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數相關分析；
? 安全：減少樣本處理與生物源性污染
? 接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環境更準確反映了體內狀況。
二、所需儀器
1.流式上樣管及細胞培養皿或板
2.25%CO2，37℃孵箱
3. 混勻振蕩器
4.離心機
5.加樣器、Tips
6.流式細胞儀
三、常用的標本類型和處理方法
全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。
自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內分析。
組織培養基中的外周血單個核細胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培養基中，調節細胞濃度為2×106細胞/ml。
細胞系與T細胞克隆：調節細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養基中。
冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。