1.METTL3的臨床相關性
TCGA數據庫中胃癌數據的搜索結果顯示METTL3在胃癌組織中高表達且與較差的臨床預后相關，這一趨勢在對60例病人的qPCR驗證結果中保持一致，且METTL3的表達量與分期分級呈一定相關性。重要的是，METTL3在彌散型胃癌（diffuse-type GC）樣本中的表達量要高于腸型（intestinal-type GC）樣本。整體水平的甲基化顯示，胃癌樣本中mRNA的m6A修飾水平要高于對照樣本。免疫組化結果顯示METTL3主要分布于細胞核。KM曲線、單因素、多因素等分析都說明METT3是一個胃癌重要的臨床預后相關因子，在GC樣本中高表達，并與GC的發生發展相關。
圖1 METTL3高表達與臨床相關性
2.METTL3是EMT過程必不可少的
免疫組化染色結果提示METTL3和N-cadherin、Vimentin表達呈正相關，與E-cadherin呈負相關。對AGS細胞系的相關檢測表明，METTL3和EMT表型、間充質標志物的重要marker蛋白呈正相關。 過表達、敲除實驗都能伴隨著N-cadherin、Vimentin以及E-cadherin的相關性變化的同時，也能引起GC細胞整體水平m6A的變化。這些結果都表明METTL3實質上能夠促進GC細胞的EMT過程發生發展。
圖2 METTL3的干預可以改變EMT相關marker的改變
3.體內體外實驗證明METTL3促進細胞侵襲與轉移
METTL3介導的EMT過程是否能引起GC細胞的轉移？劃痕實驗與transwell實驗證明METTL3表達的下調能夠明顯的阻礙BGC823細胞的遷移能力與侵襲能力，而上調能夠明顯增強MKN-28細胞的轉移能力與異位表達。尾靜脈注射的裸鼠在體實驗證明BGC823-shRNA細胞的轉移能力要明顯弱于對照細胞，反之亦然。無論體內體外實驗都說明METTL3可以增強胃癌細胞的侵襲和轉移能力。
圖4 體內體外證明METTL3具有增強轉移、侵襲能力
4. RNA-seq&m6A MeRIP-seq發現ZMYM1是METTL3的重要靶點
Mettl3的強大功能在之前的結果當中已經被證實，但是它的靶點分子有哪些？RNA-seq轉錄組測序首先明確在METTL3敲除以后哪些基因發生了差異性表達，測序結果顯示798個基因顯著下調，662個基因顯著上調。相同背景的樣本使用m6A MeRIP-seq甲基化測序發現9465和8794個m6A位點是組內特異的，GO分析發現差異甲基化的基因功能主要富集在半包橋小體組裝（hemidesmosome assembly）、中心體定位（centrosome localization）等功能，暗示m6A修飾可能會帶來染色體方面的影響。信號通路富集結果顯示多個腫瘤相關的信號通路（腎癌、甲狀腺癌以及HIF信號通路）都被有效富集，m6A經典motif也有顯著富集。 把850個甲基化水平下調的甲基化基因和798個下調的靶基因進行聯合分析把目標鎖定在其中13個基因，在這13個基因當中最終選擇帶有兩個甲基化修飾位點的ZMYM1作為下游靶標，這兩個甲基化修飾位點都存在于終止密碼子附近，在METTL3敲低以后甲基化水平都下調。目前，ZMYM1的生物學功能并不清楚，接下來需要做的工作就是搞清楚ZMYM1的功能以及甲基化的調控作用。
圖5 差異甲基化和差異表達RNA的聯合分析
5. ZYMY1與METTL3相關性探索
無論在蛋白水平還是RNA水平，METTL3的敲除的可以顯著下調ZMYM1的表達，而METTL3的過表達可以上調ZMYM1表達，實驗證明ZMYM1和METTL3呈正相關，METTL3正相關調控ZMYM1。
圖5 METTL3和ZYMY1相關性分析
6. METTL3通過依賴于HuR結合增強ZMYM1 mRNA穩定性
MeRIP-qPCR首先用于對ZMYM1 mRNA甲基化區域的驗證。在確定了ZMYM1 mRNA的甲基化位點確實存在之后，通過METTL3的過表達或敲除之后能夠明顯改變該位點的甲基化水平，進一步說明該m6A位點受METTL3的調控。通過對ZMYM1甲基化位點的單堿基突變，過表達或者敲除METTL3對該甲基化位點的調控作用就消失了。由于HuR蛋白和METTL3一樣主要分布在細胞核當中，并且一直被認為是一個由METTL3募集的間接m6A Reader蛋白，作者選擇重點關注HuR和RNA分子之間的相互結合，HuR和ZYMY1的結合區域恰巧在m6A修飾位點附近，在ZMYM1發生去甲基化（沉默METTL3）以后，HuR和METTL3的結合大大減弱，這一系列實驗證明METTL3對ZMYM1的影響是通過m6a修飾從而結合HuR蛋白來進行的。
圖6 甲基化位點的堿基突變策略以及影響HuR蛋白相互結合
7. ZMYM1復合物在核內抑制E-cadherin從而影響EMT過程
由于鋅指蛋白結構有調控轉錄活性特性的特點，猜想ZMYM1同樣在細胞核內有調控轉錄活性的作用。實驗證明ZMYM1能夠通過MYM型鋅指結構同CtBP/LSD1/CoREST復合物結合，進而增強對靶基因的轉錄抑制作用。免疫共沉淀Co-IP實驗證實了ZYMY1與CtBP/LSD1/CoREST復合物結合的存在形式。而這種復合物的存在可以有效的靶向抑制E-cadherin的轉錄。直接對ZMYM1的過表達或者敲除實驗也證明ZMYM1能夠改變胃癌細胞的遷移與侵襲行為，METTL3正是通過調控m6A影響HuR蛋白結合的方式來改變METTL3的表達量，進而促進胃癌細胞的EMT過程。
總結
RNA甲基化作為當下生命科學的研究領域最熱主題被廣泛研究，在多種疾病當中均有顯著調控作用，花樣繁多的作用方式可以從RNA分子核內轉錄到核外成熟從而影響其分子一生。這項研究成果讓讀者從新的角度來解釋甲基化對腫瘤EMT的影響。