核苷可從水解核酸來制備。用吡啶水溶液、氧化鋁或酶促水解核糖核酸RNA，可得到核糖核苷；
用氧化鋁或酶水解脫氧核糖核酸DNA可得到脫氧核糖核苷。
核苷也可用化學方法合成。適當保護的核糖或脫氧核糖與堿基衍生物縮合，可得到相應的核糖核苷和脫氧核糖核苷。或在糖的C1上先形成碳－氮和碳－碳鍵，然后閉環成雜環堿基而得到核苷。
