基本方案 溫和去垢劑裂解法（對貼壁細胞）
基本方案 溫和去垢劑裂解法（對非貼壁細胞）
SDS煮沸法裂解細胞
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 待標記的培養細胞 |
| 試劑、試劑盒 | 37℃標記培養液 1 Ci／ml H3(32)PO4(溶于 HCl) 冰冷 Tris 平衡鹽水(TBS) ／磷酸鹽平衡鹽水(PBS) 溫和裂解緩沖液／RIPA 裂解緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 樹脂玻璃擋板(1 in 厚) 取液器吸頭 樹脂玻璃盒 37℃微量離心管 一次性吸管 橡皮細胞刮子 Sorvall 冷凍離心機(或其他) 樹脂玻璃薄板／4℃ 樹脂玻璃管架 |
| 實驗步驟 | 實驗試劑儀器的具體要求見「其他」。 1. 培養待標記的細胞至適當的生長期。 生長旺盛的細胞中磷酸鹽轉運達到最高峰，除非研究靜止期細胞的蛋白質磷酸化，一般待標記的細胞生長密度不要達到匯片，標記前 3～18 h 換新鮮的培養液培養將有利于標記。 2. 吸去培養液，用 37℃ 的含血清不加標記物的標記培養液洗盡殘存的含磷酸鹽的培養液，吸盡該培養液。 3. 加入預熱的標記培養液，加入量為：（0.5～1 ml）/35 mm 培養皿，（1～2 ml）/50 mm 培養皿，或（2～4 ml）/100 mm 培養皿。 4. 在樹脂玻璃擋板后操作，使用配備塞有棉花防浮質吸管的微量移液器加入 32P 至終濃度為 0.1～2 mCi/ml。 標記 1～2 h 已足夠，但細胞可在 6 h 內耐受高達 2 mCi/ml 和在 18 h 內耐受低濃度（0.1～0.5 mCi/ml）的輻射。 5. 將培養皿置于預熱的樹脂玻璃盒中，并將盒子置于培養箱中。 6. 標記結束時，將裝有標記細胞的樹脂玻璃盒移至冷室，放在樹脂玻璃擋板后面。 7. 從樹脂玻璃盒子中取出培養皿，用一次性的移液管吸盡標記培養液，培養液和吸頭或吸管均作為同位素廢物棄置。 8. 用 2～10 ml 冷 TBS 洗滌細胞 2 次，同步驟 7 一樣吸盡并棄去放射性廢物。 9. 加適量裂解緩沖液（0.3 ml/35 mm 培養皿，0.6 ml/50 mm 培養皿或 1.0 ml/ 100 mm 培養皿），用橡皮細胞刮子擦刮下貼壁細胞，裂解物留在培養皿上，4℃ 放置 20 min。用橡皮細胞刮子將貼壁細胞的裂解液移至培養皿邊緣，并將裂解液移入帶螺口蓋的微量離心管中。 10. 蓋上管蓋，于 4℃ 26000 g 離心 30 min 澄清裂解液。 11. 離心后，將上清（裂解物）移至新離心管中，離心管和沉淀作為同位素污物處理。 12. 用凝膠電泳、免疫沉淀或蛋白質純化方法，分析標記的裂解液，所有過程均在4℃ 適當屏蔽下進行。 |
| 注意事項 | 1. 除非特別說明，細胞培養在加濕的 37℃，10% CO2 培養箱中進行。 2. 步驟 7 中，不能用真空泵吸標記培養液。真空泵抽吸會產生放射性氣溶膠并在儀器中留下放射性薄層。繼續 Plexiglas 擋板后處理細胞和裂解。 3. 步驟 9 中，如果需要降低由非特異性雜質造成非特異性的背景，可使用 RIPA 裂解緩沖液。如果要求保持酶 的活性或蛋白質復合物的結構，使用含 CHAPS （3-膽酰胺丙基-二乙胺丙磺酚）或 Nonidet P-40 （乙基苯基聚二乙醇，即 NP-40）作為唯一去污劑的溫和裂解緩沖液。要完全溶解細胞和使蛋白質變性，使用SDS裂解方法。 4. 步驟 10 中管內液體最好是裝至半滿以防液體濺出。 用 RIPA 緩沖液制備裂解液時，由于細胞核的溶解常導致細胞裂解液變得黏稠。當發生這種情況 時，延長離心時間到 90 min，或離心前在 RIPA 液中加入 50 μl 固相化金黃色葡萄球菌，都可使 DNA 沉于管底。 |
| 其他 | 試劑： 標記培養液：不含磷酸鹽的細胞培養液 （如 DMEM），添加了常規濃度的血清或用無磷酸鹽的鹽水透析過的血清，37℃ 溶于 HCl 中的 1 Ci/ml H332PO4 （無載體，ICN） Tris 平衡鹽水（TBS） 或磷酸鹽平衡鹽水（PBS），冰冷 溫和裂解緩沖液或 RIPA 裂解緩沖液 儀器： 1 in 厚的樹脂玻璃擋板 塞有濾芯的防浮質的取液器吸頭 樹脂玻璃盒，預熱到 37℃ 帶螺口蓋的微量離心管 一次性的吸管（塞有棉花） 橡皮細胞刮子 Sorvall 冷凍離心機，帶 SM 24 轉子和橡皮套管，或其他相當的冷凍離心機，4℃ 樹脂玻璃薄板 （10 in × 10 in × 1/4 in） 或樹脂玻璃管架，4℃ |