果蠅RNA的大規模制備

試劑、試劑盒 5mol LLiCl 70% 乙醇 酚：氯仿（1:1) 20 mg ml 蛋白酶 K 95%(V V) 乙醇 .RNA 勻漿緩沖液 3mol L 乙酸鈉

實驗步驟

一 材料與設備

1)5mol/L LiCl

2)70% 乙醇：70% (V/V)Ethanol，l0 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)

3) 酚：氯仿（1:1): 酚用 0.1mol/L Tris-HCl(PH8.0) 平衡

4)20 mg/ml 蛋白酶 K

5)95% (V/V) 乙醇

6)RNA 勻漿緩沖液：0.5%(m/V)SDS, 10 mmol/L EDTA\(PH8.0)，50 mmol/L NaCl，高壓滅菌，加入 Tris-HCl (PHI7.5)  至終濃度為 50 mmol/L

7)3mol/L 乙酸鈉 ( PH5.5 )。

二 操作方法

1) 吸取 2 mlRNA 勻漿緩沖液到 7 ml 的 Dounce 勻漿器中。

2) 加入 37.5 蛋白酶 K，再立即放入果蠅或其胚胎。用 A 型研杵均勻地勻漿 50 下。

3) 勻漿勻漿液轉移至 15 mL 錐形管中。37℃ 溫肓 45?70 min

4) 如入等體積的酚：氯仿，蓋緊后振搖混合 10s

5) 以 1000 g 離心 5 min 分離冇機相和水相。

6) 上層水相轉移到一個新管中

7) 有機相中加入 1 ml 新的 RNA 勻漿緩沖液. 混合后再按前述方法離心分層。

8) 混合兩次的水相，再加入 4 ml 酚：氯仿。

9) 以 1000 g 離心 5 min, 分離冇機相和水相。

10) 上層水相轉移至一新管屮，加入 0.5 ml3mol/L 乙酸鈉. 顛倒混合后加入 2?2.5倍體積的 95% 乙醇，顛倒混合。

11)—20℃ 放置 2 h 或—80℃ 放至凝固，以沉淀 DNA 和 RNA

12) 以 12000 g 離心 lOmin, 棄上清。再用 5 ml70% 乙醇漂洗沉淀，去掉上清

13) 在空氣屮或真空屮干燥沉淀. 用 0.5 mlDEPC 水溶解沉淀. 并轉移到 1.5 ml 的離心管屮。

14) 為去掉 DNA, 加入等休積的 LiCl 并振搖混合。

15)—20℃ 放置 2 h 或 4℃ 過夜以沉淀 RNA

16) 以 12000 g 離心 10 min, 去上清并在空氣中干燥或真空干燥。

17) 用 0.4 mlDPEC 水溶解沉淀. 可 4℃ 放置過夜以溶解

18) 加入 50ul3mol/L 乙酸鈉和 0.9 ml95% 乙醇. 顛倒混合后-20℃ 放置 2 h 以沉淀 RNA

19) 在微量離心機屮以最大轉速離心 10 min, 去上淸，再用 0.5 ml70% 乙醇漂洗沉淀

20) 在空氣或真空屮干燥，用 180ulDEPC 水溶解沉淀。分裝成適當的體積于-70℃ 保存。

注意事項

1) 本方法可從果蠅成蟲或胚胎中制備 RNA。對胚胎而言，須先去膜，再中和，使用前用 DEPC 水漂洗去膜的胚胎。

2)RNA 沉淀在真空屮干燥后可能較難溶解，可以在加熱幾分鐘并用吸頭輕輕混合以幫助溶解.

3）A260/280 應該大于或等于 1.9，如果比值低于 1.9, 則可能是在 RNA 制備中有蛋白污染。可以通過酚：氯仿抽提的方法去掉蛋白。