除臨床表現外，確診主要依據病原學檢查，如：血及其他標本的培養、腦脊液涂片與培養等。李斯特菌溶素0的抗體測定及PCR檢測對急性病例診斷并無確定作用。李斯特菌溶素0的抗體水平對經食物傳播的非侵襲性感染如：胃腸炎的診斷意義也不大。細菌溶素0的氨基末端多肽是更具特異性的抗原，以此開發的血清學測定可能更有臨床診斷價值。
下列情況應懷疑本菌感染:
①新生兒敗血癥與腦膜炎；
②有血液系統腫瘤、艾滋病、器官移植、使用皮質激素的病人；
③孕期發熱。以上病人白細胞計數及中性粒細胞增高，且單核細胞超過8%。
腦脊液涂片檢查應注意勿誤認為肺炎球菌、流感桿菌或類白喉桿菌。本菌所致的腦脊液變化與其他細菌性腦膜炎相似，白細胞分類的變異甚大。