李斯特氏菌的檢驗方法（一）

李斯特菌（也稱李氏桿菌）引起的急性傳染病，以敗血病為主要癥狀，伴有內臟器官和中樞神經系統病變。李斯特菌是1926年英國南非裔科學家穆里在病死的兔子體內首次發現的，為紀念近代消毒手術之父、英國生理學家約瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三屆國際微生物學大會命名為李斯特菌。

單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛生微生物檢驗中，必須加以重視。

李斯特菌在環境中無處不在，在絕大多數食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品、蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應的標準。

其中單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。

實驗步驟

1. 增菌培養

將未開封的測試片貯藏在≤8℃的環境下，并在包裝上標示的有效期內使用。在高濕度的地方，最好在使用前將測試片回復到室溫。

取回的樣品應在4℃下處理、存放和運送，如果是冷凍樣品，則在檢驗前要保持冷凍狀態。

取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質杯中進行均質，然后轉入三角瓶中，30℃培養4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續培養20h和44h。

2. 分離

共培養24h和48h后，取EB培養物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3 LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養24-48h，LPM平板在30℃培養24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。

已開封的測試片，將開口反折，用膠帶封好。

加入七葉苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系統，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個黑色環，其它菌也可形成黑色環，但形成時間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。

在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個菌落。食品檢驗中在TSAYE平板上純化是必須的，因為在PALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的原因是一個樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養24-48h，如果不用于動力觀察，也可在35℃培養。

3. 鑒定步驟

為防止暴露于潮濕的環境中，請不要冷藏已開封的測試片。將膠帶封好的測試片貯藏在低溫干燥的地方，保持時間不超過1個月。請勿將測試片放在溫度> 25℃和(或)相對濕度>50%的環境中。

1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。

2）從30℃或更低溫度下培養的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現非運動性。李斯特氏菌是細短桿菌，可見輕微的旋轉及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對照相比，球形、大的桿狀且快速泳動的都不是李斯特氏菌。

3）挑取典型菌落進行過氧化氫酶實驗，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。

4）取16-24h的培養物進行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培養物革蘭氏染色會發生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認為白喉菌而錯判。