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  • 發布時間:2019-10-21 06:27 原文鏈接: 方案22.3貼壁細胞的克隆形成實驗

               

    實驗方法原理 用不同濃度的實驗試劑將細胞處理24h 。經胰蛋白酶消化后,以低細胞密度接種,溫育1~3 周,染色后(見彩圖6a,e) 計集落數(圖22.1)。
    實驗步驟

    材料

    無菌

    生長液
    D-PBSA
    0.25%粗制胰蛋白酶
    待測化合物配制成最大使用濃度的10倍,溶于無血清生長液中;檢査試驗溶液的pH 和滲透壓,若需要的話,予以調整;
    培養瓶,25cm2
    培養皿,6cm 或9cm,在底皿的邊上做標記

    非滅菌

    D-PBSA
    甲醇
    1 % 結晶紫
    血細胞計數板或電子細胞計數器

    操作步驟

    1. 準備一系列在25cm2的培養瓶中培養的細胞,6 組試劑濃度,每組各3 瓶,另有3 組作對照。在每個培養瓶中接種4.5 ml 細胞懸液(細胞密度為每毫升生長液5X104個細胞),溫育48h ,屆時細胞將進入對數生長期(見21. 9.2 節)。

    2. 制備一系列待測物質的稀釋液,每組2ml,為所需終濃度的10倍:

    (a) 若是首次測試的化合物,在3~5 個對數生長范圍內采用5 倍稀釋;
    (b ) 若是能夠預測大致的毒性濃度,那么就選擇一個較窄的算術范圍,每組相隔10或20 數量級。

    3. 在每組濃度的3 個培養瓶中各加人0.5 ml 10倍濃度的待測化合物,使其稀釋10倍。先從對照組(不含待測物質)開始,然后從低濃度向髙濃度進行。

    4. 將培養瓶放回孵育箱。

    5. 若化合物作用緩慢或可部分逆轉,那么重復第3 步兩次,也就是將細胞暴露在試劑中3 天,每日更換培養基及化合物,這樣培養基及待測化合物即可得以更新。對于快速作用的化合物,暴露1h就已足夠。

    6. 依次將每組3 瓶中的生長液傾去(從最低濃度向最高濃度進行),用胰酶消化細胞。

    7. 將細胞稀釋至克隆生長所需的密度(見方案14.1),接種于培養皿中。以與對照組相同的數量稀釋所有細胞,從最高濃度的培養瓶至最低濃度組,最后稀釋對照組。

    8. 溫育細胞直至集落形成。

    9. 用無水乙醇固定細胞,用1% 結晶紫染色10min (見方案16.3)。

    10. 用自來水清洗培養皿,吸去水分,倒置干燥。

    11. 對多于50 個細胞的集落(多于5個世代)進行計數。生長曲線的分析

    12. 計算每組藥物濃度下的細胞貼壁效率。

    13.計算相對貼壁效率:每組濃度的貼壁率/對照組的貼壁率,這是細胞存活分數。

    14. 依據所用的的濃度范圍,在對數或線性藥物濃度下,繪制細胞存活分數曲線圖(圖22.2)。

    15. 確定IC50或IC90,它們分別是50% 或90% 的集落形成被抑制時的化合物濃度。由于這是一個半對數曲線圖,IC90更為適用,因為它更可能落在曲線的線性部分;而IC50。往往落在曲線的彎曲部分,這樣它的穩定性就比較差。

    16.敏感性差異曲線的分析:
    (a) 曲線的斜率和彎曲部分的長度。曲線的斜率較淺和/或彎曲部分較長表示敏感性降低;斜率較陡和/或彎曲部分較短表示敏感性增加。彎曲部分的長度及斜率對IC50和IC90均有影響,而在IC90可以觀察到更顯著的差異(圖22.3),并且IC90常作為一個簡單的導數;
    (b) 抗性分數。細胞抗性分數是指曲線下端的平坦部分;
    (c) 缺乏曲線梯度則表示所有細胞均有抗性;
    (d) 曲線下面積:復雜的生存曲線可以通過計算曲線下的面積進行比較,但這樣做只是為了方便,從數學上來講并不是很有根據。



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