探針的非放射性標記技術1

核酸探針是指能與特定核酸序列發生特異性互補的寡核苷酸鏈。核酸探針有雙鏈DNA探針、單鏈DNA 探針、RNA探針和寡核苷酸探針。特異性探針來源于目的核酸的酶切片斷、dd-PCR等差異顯示中出現的差異片斷、AFLP、RFLP、RAPD、SSR、CFLP等標記實驗中出現的特異性基因標記片斷。可以通過人工合成、酶切、PCR等手段富集探針。探針必須帶上標記才能有用，不帶標記的探針稱為裸探針。探針標記是進行雜交及一些分子標記研究的前提。探針標記有單鏈標記、雙鏈標記、直接標記及間接標記，放射性標記和非放標記。本實驗主要介紹非放標記。目前國內外使用的非放標記主要有光敏生物素標記、地高辛標記及ECL直接化學發光標記等。

1光敏生物素對探針的標記

在強可見光的照射下，光敏生物素中的N3基團光解放出N2,生成反應活性極高的氮烯；N基團，易與核酸堿基中的伯胺基結合而形成共價標記。核酸中每100-150個堿基可結合一個生物素。

一：儀器：光標記燈離心機

二：試劑

光敏素試劑盒

光敏素試劑醋酸鹽

親和素－堿性磷酸酶檢測系統

親和素－堿性磷酸酶

BCIP(實驗時10mg溶于200μlDMF中)

NBT(實驗時15mg溶于200μl70%DMF中)

二甲基甲酰胺（DMF),仲丁醇, 3ＭNaAC無水乙醇

三：操作

（一）核酸探針的光敏素標記

１：在一支滅菌的Eppendof離心管中加入20μl探針DNA(0.5-1μg/μl，溶解于水中

2：避光條件下加等體積的光敏生物素醋酸鹽并混勻。

3：將裝有反應液的離心管置于冰模中，暗室中在光標記燈下照射30分鐘（燈距樣品15cm）。

4：加入無菌水至總體積為100μl

5：加入100μl仲丁醇，混勻。10000rpm離心10min,去上層液，再加入仲丁醇，離心，使水相濃縮至30-40μl。

6：加入4μl的3M NaAC,混勻，再加入２體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃過夜或-70℃15min

7：4℃15000rpm 離心15min,取桔紅色沉淀。

8：真空干燥，沉淀溶于無菌水中。

注：1仲丁醇與水能部分互溶，因此最好先用水將其飽和，以防DNA丟失，如不飽和則可起到濃縮水相的作用，

2：買來的或要來的探針一般都保存在TE緩沖液中，因此在使用前脫鹽，否則光敏素與Tris反應，使電泳條帶拖尾。

3：在沉淀探針時，NaAC能不加，盡量不加。沉淀離心是最好在低溫下進行，

2地高辛對探針的標記

帶有地高辛標記的dUTP（圖14-1）通過缺口翻譯、隨機翻譯或PCR等反應而使探針核酸片段帶有地高辛，進一步可與帶有AP、CSP等各種抗地高辛抗體復合物發生免疫反應，使探針上帶有AP等分鐘，進一步能催化化學或發光反應。圖14－2為各種DIG標記探針及檢測類型匯總；圖14－3為DIG標記探針的方法；圖14－5為標記探針應用；圖14－4為DIG標記探針的檢測方法。

圖14－1DIG標記dUTP結構圖
圖14－2：DIG標記圖示
圖14－3DIG標記探針方法
本實驗擬通過隨機引物及PCR方法，將DNA探針片段用DIG標記，進一步掌握探針的標記技術。

隨機引物法標記DIG探針

1：1ug(10ng <DNA探針量<3ug)待標記DNA溶于16ul水中，在沸水浴10分鐘變性，迅速放于冰浴（NaCl或乙醇冰浴）冷卻。

2：在冰浴上，上述管中加入4ulDIG－HIGH－Prime混合物（含5×反應緩沖液、50％甘油、各1mM的dATP,dCTP,dGTP,0.65mM的dTTP及0.35mM的DIG－dUTP ，1U/ulKlenow酶）。

3：離心混合，3760分鐘或過夜

4：加2ul0.2MEDTA(pH8.0)或65℃10min終止反應。

5：在上述20/22ul反應體系中加入2.5ul4MliCl,75ul(-20℃預冷)乙醇沉淀,70%乙醇洗沉淀，真空干燥，復溶于少量PH8.0TE中，－20℃保存（忌諱反復凍融）。

3：ECL方法對探針的標記