實驗概要
了解植物細胞懸浮培養的基本原理，通過實驗掌握植物細胞懸浮培養的方法和技術。并通過實驗練習和鞏固無菌操作技術。
實驗原理
植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。植物離體培養可產生愈傷組織。將疏松型的愈傷組織縣浮在液體培養基中并在振蕩條件下培養一段時間后，可形成分散縣浮培養物。良好的縣浮培養物應具備以下特征：（1）主要有單細胞和小細胞團組成；（2）細胞具有量盛的生長和分裂能力，增殖速度快；（3）大多數細胞在形態上應具有分生細胞的特征，它們多呈等徑形，核一質比率大，胞質濃厚，無液胞化程度較低。
在液體懸浮培養過程中應注意及時進行細胞繼代培養，因為當培養物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。對于多數懸浮培養物來說，細胞在培養到第18～25d 時達到最大的密度，此時應進行第一次繼代培養。在繼代培養時，應將較大的細胞團塊和接種物殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細胞懸浮培養體系，就包括愈傷組織的誘導、繼代培養、單細胞分離和懸浮培養。目前這項技術已經廣泛應用于細胞的形態、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經過轉化的植物細胞再經過誘導分化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。
主要試劑
B5培養基加上0.2mg NAA（naphthalene acetic acid）的液體培養基（取3.2g B5粉末培養基，蔗糖30g，200ul體積質量為1mg/ml的NAA貯備液，溶于約800ml蒸餾水中，置于磁力攪拌器上混合均勻，pH計測定pH 值，1mol/l KOH調節pH值至5.8，加蒸餾水定容至1L，鋁箔紙封口后121℃滅菌20min，貯于4℃冰箱，接種前水浴或自然升至室溫）。
主要設備
1. 超凈工作臺
2. 高壓滅菌鍋
3. 旋轉式搖床
4. 水浴鍋
5. 倒置顯微鏡
6. 鑷子
7. 酒精燈
8. 三角瓶
9. 移液器
10. pH計
11. 恒溫培養室
12. 漏斗
13. 不銹鋼篩
14. 血球計數板等
實驗材料
擬南芥愈傷組織
實驗步驟
1. 用鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織，放入三角瓶中并輕輕夾碎。每100ml三角瓶含滅過菌的培養基 10~15ml，每瓶接種1~1.5g愈傷組織，以保證最初培養物中有足夠量的細胞。
2. 將已接種的三角置于旋轉式搖床上。在100r/min，25~28℃條件下，進行振蕩培養。
3. 經6~10天培養后，若細胞明顯增殖，可向培養瓶中加新鮮培養基10ml，必要時，可用大口移液管將培養物分裝成兩瓶，繼續培養。（若細胞無明顯增殖，可能是起始材料不適當，應考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）。可進行第一次繼代培養。
4. 懸浮培養物的過濾：按“3”法繼代培養幾代后，培養液中應主要由單細胞和小細胞團（不多于20個細胞）組成。若仍含有效大的細胞團，可用適當孔徑的金屬網篩過濾，再將過濾后的縣浮細胞繼續培養。
5. 細胞計算。取一定體積的細胞縣液，加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3），置70℃水浴處理15min。冷卻后，用移液管重復吹打細胞懸液，以使細胞充分分散，混勻后，取一滴縣液置入血細胞計數板上計數。
6. 制作細胞生長曲線：為了解縣浮培養細胞的生長動態，可用以下方法繪制生長曲線圖：
1) 鮮重法（fresh weigh method）在轉代培養的不同時間，取一定體積的懸浮培養物，離心收集后，稱量細胞的鮮重，以鮮重為縱座標，培養時間為橫座標，繪制鮮重增長曲線。
2) 干重法（dry weigh method ）可在稱量鮮重之后，將細胞進行曲烘干，再稱量干重。以干重為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制細胞干重生長曲線。
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次，共取7次，每個樣品重復三次，整個實驗進行期間不再往培養瓶中換入新鮮培養液。
7. 細胞活力的檢查。對于初學者，往往需要檢測活細胞的比率。可在培養的不同階段，吸取一滴細胞縣液，放在載玻片上，滴一滴0。1%的酚藏花紅溶液（用培養基配制）染色，在顯微鏡下觀察。幾活細胞均不著色，而死細胞則很快被染成紅色。也可用0。1%熒光雙醋酸酯溶液染色，凡活細胞將在紫外光誘發下顯示藍絕色熒光，有經驗的操作者，則可根據細胞形態，胞質環流判別細胞的死活。
8. 細胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養細胞是否仍具有再生能力，可將培養細胞轉移到瓊脂固化的培養基上，使基再形成愈傷組織，進而在分化培養基上，誘導植株的分化。
注意事項
1. 上述步驟均滅菌操作，培養基、用具、器皿等要高壓滅菌后方可使用。
2. 如培養液混濁或呈現乳白色，表明已污染。
3. 每次繼代培養時，應在倒置顯微鏡下觀察培養物中各類細胞及其它殘余物的情況以有意識地留下圓細胞，棄去長細胞。
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