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  • 發布時間:2022-03-07 15:39 原文鏈接: 抗原抗體反應抗體基因文庫

      抗體基因文庫(antibody recombination library)是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合,克隆到合適的表達載體中,在原核細胞表達不同的抗體,形成一個抗體庫,從這個抗體庫中,用抗原可以篩選到相應的抗體基因。抗體基因來源于雜交瘤細胞或動物B細胞(免疫或未免疫)的DNA和mRNA。

      用質粒作為抗體文庫的載體,雖然也可能表達有活性的抗體分子或片段,但由線狀噬菌體表達更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成:pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每種含量不一,其中pⅧ含量最多,每個噬菌體有2700個pⅧ亞基,其余4種蛋白僅5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度并不影響噬菌體的裝配,抗體以融合蛋白的形式表達于噬菌體表面。噬菌體表達質粒常用的有fd-CAT1、fd-tet-DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗體融合蛋白構建多用pⅢ和pⅧ,pⅧ拷貝數高,低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。

      在噬菌體表達抗體時,常常不表達完整的抗體分子,(因為CH2上不能進行糖基化)。根據不同的引物得到重鏈的VH或VHCH1區,輕鏈的VL或VLCL區。VL和VH兩個片段用一短肽作連接片段,形成單鏈可變區(single-chain fragment variable,scFv);VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外,單獨的VH和VL也能結合抗原,如果二者形成同源或異源二聚體(dAb),則穩定性和親和性明顯提高(圖7—4)。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白(如堿性磷酸酶和蛋白毒素)的基因,則表達的抗體就帶有一定生物活性功能片段,可用于檢測或治療。如果在抗體基因末端加上終止子(TAG)則表達的抗體片段是可溶性的,而不是結合在噬菌體表面。

      用特異性抗原免疫的動物B細胞構建抗體的噬菌體文庫,抗體親和性高,用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低。可用模擬天然體細胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法,即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下,再克隆至隨機的文庫中的V區構成二級文庫,使H鏈和L鏈混雜,可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯配將隨機突變引人至抗體的抗原結合區,也能提高對抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的PⅧ表達,篩選后、將抗體基因片段PCR擴增轉至PⅢ上表達,可獲得高親和力的抗體片段。

      抗體基因文庫有兩個優點,一是從不適合進行人工免疫的物種獲得單克隆抗體,如人源單克隆抗體;二是可快速方便獲得單克隆抗體。

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