微生物限度檢查法
對于口服藥及外用藥,不必要求達到無菌狀態,但要保證藥物的衛生質量。這就要求進行微生物限度檢查。微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。控制菌檢查指大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的檢查。
微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下、局部潔凈度100級的單向流空氣區城內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染。單向流空氣區域工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。
(一)檢查前的準備工作
1.培養基的制備 微生物限度檢查所用的培養基很多,如營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、酵母浸出粉葡萄糖瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基等,其配方和配制過程均需按《中國藥典》規定的配方制備或者使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配制后,應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
2.菌液的制備
(1)菌種:驗證試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術,以保證試驗菌株的生物學特性用作陽性對照的菌種有:大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌(SapHylococcus aureus)[CMCC (B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501]、白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus nige)[CMCC(F)98003]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphiB)[CMCC(B)50094]生孢梭菌(Clastridium sporogenes)[CMCC (B)64941]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]。
(2)菌液制備:接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中;生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中,培養18~24時;接種白念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中,培養24~48小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50-100CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中,培養5～7天,加入3~5ml含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布、能過濾菌絲的無菌毛細吸管)至無菌試管內,用含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50-100CFU的孢子懸液。
3、稀釋液的制備
(1)pH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖液:取磷酸二氫3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g、加水1000ml,微溫溶解,濾清,分裝,滅菌。
(2)pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液:按《中國藥典》附錄配制。
如需要,可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
(3)09%無菌氯化鈉溶液:取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml,過濾,分裝,滅菌然后過濾,分裝,滅菌。
稀釋液配制后,應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
(二)方法驗證試驗
當建立藥品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用的方法適于該藥品的細菌霉菌及酵母菌數的測定和控制菌的檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證。供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性驗證及對微生物的生長和存活無影響。
驗證時,規定按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數及控制菌檢查法所規定的方法及要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。依各品種項下微生物限度標準中檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株,驗證大腸菌群檢查法時,應采用大腸埃希菌作為驗證菌株。
驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查同時進行。