微流控芯片技術的肺癌循環腫瘤細胞檢測及單細胞分析

我國是肺癌高發國家,近十年肺癌的發病率分別占男性和女性惡性腫瘤的第一和第二位,并且發病年齡有下降的趨勢。肺癌的死亡率在惡性腫瘤中始終居于首位，根本原因是肺癌的高轉移能力。因為肺癌具有極強的侵襲性及轉移能力，大多數患者就診時已處于晚期（III期、IV期），失去最佳的治療機會。因此，提高肺癌檢出率、控制轉移是臨床亟待解決的難題。

    現有的肺癌診斷手段主要包括影像學、血清腫瘤標志物、組織病理學和細胞學檢查。影像學檢查能夠直觀地評價肺癌的大小和進展情況，但靈敏度有限，很難檢測到微小病灶。血清腫瘤標志物檢測可用于輔助診斷、監測腫瘤進展和復發，但是目前尚缺少特異的肺癌血清腫瘤標志物，易出現假陽性和假陰性。病理學和細胞學診斷是肺癌診斷的“金標準”，但是要通過手術或者穿刺的方法獲得活檢樣本，對患者創傷較大，而且取材受限，不能實時監測肺癌的動態發展。

循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell, CTC）檢測作為一種液體活檢技術，試圖克服現有肺癌診斷手段的不足，提高肺癌檢出率。研究表明CTC檢測有助于預測腫瘤轉移、評估預后，而且可以反映腫瘤特征，作為靶向治療的靶標指導治療。同時，外周血CTC檢測具有創傷小、順應性好、操作方便及可重復操作等優勢。因此，作為一種“液體活檢”技術，CTC檢測有助于提高肺瘤的檢出率，為患者爭取最佳治療時間，制定最適的治療方案，從而改善患者預后。然而，由于CTC數量微少，平均109個血細胞中約有1-100個CTC。因此，構建高效、高特異性的檢測方法對CTC的臨床應用至關重要。

現有的CTC檢測和富集分選技術依據分離原理的不同，主要分為兩大類，一類是基于物理學特性的分選，另一類是基于生物學特性。前者主要是依據腫瘤細胞與血細胞的尺寸不同、密度不同、所帶電荷不同等方法將CTC從外周血中分選。優點是操作簡單、快捷、高通量且成本相對較低等，但缺點是分選效率不高、純度較差。后者主要是依據免疫學反應，根據CTC表面所表達的特異性蛋白，通過免疫親和反應將其分離，其中最常見的特異性蛋白是上皮粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）及細胞角蛋白（Cytokeratin, CK）。其中，被FDA認證的Cellsearch System就是根據正分選原理，通過納米磁顆粒富集上皮來源的CTC，推薦應用于轉移性乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌的CTC檢測。但是，由于CTC具有較強的異質性，使該方法在一些患者中的CTC檢測效果并不理想 。因此，如何克服CTC檢測手段的局限性，構建高效的CTC檢測技術倍受關注。

    隨著微流控技術對細胞生物學影響的不斷加深,以及其在集成樣品預處理和血液成分分析中的優勢，使其可以更溫和、快速、一致地操控和分選活細胞，有利于更準確高效地提取血液等體液樣品中的信息，非常適用于血細胞、癌細胞等體細胞的檢測。近年來，國內外學者在腫瘤細胞的微流控分選領域中取得了一系列的成就，微流控芯片技術正逐步成為細胞分選的主要工具，應用微流控芯片技術可精確操控樣品中的細胞，有望實現高效率、高純度的CTC檢測。同時，微流控芯片的制作成本較低、體積較小，易于制備便攜式儀器，更易臨床普及應用。基于微流控芯片的CTC檢測方法主要分為兩類，一類是基于物理學特性的檢測，另一類是基于生物學特性。前者最常見的是應用過濾芯片或確定性側向位移（deterministic lateral displacement, DLD）芯片，根據細胞尺寸大小的不同，將CTC與血細胞分離。Zheng等設計的濾過膜芯片在0.1-0.2mL/min的通量下可實現80%的腫瘤細胞株捕獲率，Chen等設計的DLD芯片在1mL/min的通量下可實現95%的腫瘤細胞株捕獲率。生物學特性的分選主要是根據免疫親和反應將CTC捕獲，其中最常見的是“人字”芯片或“HB芯片”，HB芯片是在普通芯片的基礎上通過人字形微柱的設計，使血樣流經芯片時產生微量渦流來實現血液細胞的被動混合，以顯著增加目標CTC和抗體包被芯片表面之間的相互作用次數，顯著提高CTC的分離效率。Shannon等設計了人字形魚骨芯片，在流速(0.12 mL／h)下可實現79%±4.5%腫瘤細胞捕獲效率及50%左右捕獲純度。Nagrath等將anti-EpCAM抗體包被在芯片微柱上，通過腫瘤標準細胞株檢測，實現99%的高捕獲效率及47%的捕獲純度。以上研究提示，應用微流控芯片技術有望克服CTC檢測技術的不足，實現高效、高特異性的CTC檢測，但是目前大多研究是在細胞株水平進行的，對患者外周血CTC檢測的研究尚不足。

因此，應用微流控芯片技術，國內某研究小組構建了適于肺癌CTC檢測的裝置，并將該裝置用于患者外周血CTC檢測。該裝置聯合了DLD分選平臺、磁場負性分離純化平臺及免疫親和捕獲平臺，以實現高效的、高特異性的CTC檢測。應用該裝置，國內某研究小組分別對標準細胞株、肺癌患者CTC進行檢測，并與CTC檢測金標準CellSearch System的檢測結果進行了對比。標準細胞株的檢測結果提示該裝置可實現90%以上的檢測效率及50%的檢測純度，且該裝置對細胞的活性無明顯影響，可用于下一步的相關分析。肺癌患者外周血CTC的檢測結果進一步證實了裝置具有良好的檢測效能。芯片裝置與CTC檢測金標準CellSearch System對30例腫瘤患者外周血CTC檢測結果提示二者在檢測效能上無明顯差異，但是在檢測所需標本量、檢測時間、檢測成本、臨床普及性等方面，芯片裝置具備明顯的優勢。以上實驗證實了芯片裝置具備良好的CTC檢測效能，可用于臨床CTC檢測。因此，國內某研究小組應用該裝置對55例腫瘤患者外周血CTC進行檢測，分析了CTC數目與腫瘤分期、腫瘤轉移及患者病情的關系，檢測結果提示CTC數目與腫瘤分期相關，早期（I、II）患者，檢測結果為陰性，晚期患者（III、IV），檢測結果通常為陽性，且隨著分期的增高，檢出陽性率逐漸升高。而且檢測結果與腫瘤轉移相關，檢測結果為陽性的患者通常已出現轉移，而未出現轉移的患者，檢測結果為陰性。另外，檢測結果與患者病情相關，對于病情復發或進展的患者，檢測結果通常為陽性，對于病情緩解或穩定的患者，檢測結果為陰性。綜上所述，應用微流控芯片技術，我們課題組成功構建了CTC檢測裝置，可用于肺癌患者的CTC檢測，且檢測結果有助于臨床肺癌分期、轉移狀態評估、患者病情分析及治療方案的選擇。

隨著精準醫學時代的到來，肺癌的診治正在一步步向精準化、個體化、綜合化的治療方向發展。而這種發展方向是有原因的，首先，肺癌是一種基因疾病，多樣且復雜，即使在顯微鏡下形態一致的腫瘤，在臨床上卻可能有著截然不同的療效以及預后；其次，肺癌本身在分子遺傳學上具有異質性，并且隨著疾病的進展處于不斷演化的狀態；最后，因為肺癌治療藥物價格高昂，不恰當的治療將會給病人甚至是整個社會造成沉重的負擔和資源浪費。由此肺癌精準醫療應運而生，CTC檢測這一液體活檢技術的到來，為肺癌精準醫學的實現帶來了新的希望。最近，已經有大量針對CTC的分子研究，從富集的CTC群體中提取細胞DNA和RNA進行深入的基因組學分析，但由于CTC的富集過程存在白細胞的污染，所以分析結果缺乏準確性。例如，Punnoose等人分析了CellSearch?在非小細胞肺癌（NSCLC）患者中富集的CTC中的EGFR突變狀態，在腫瘤活檢確認攜帶EGFR突變的8例患者中只有一例可檢測到基因突變。隨著研究的進展，單個CTC的基因組分析克服了白細胞污染所造成的限制，能夠評估單個CTC之間的異質性并有助于鑒定細胞內共存的突變。而且CTC單細胞基因組測序分析可從分子水平明確腫瘤發生、發展、轉移及耐藥的機制，從而實現精準醫療。單細胞的分選方法主要包括顯微鏡下手動毛細胞吸取法、阻抗脈沖信號芯片捕獲法、陣列芯片分選法等。目前，我們課題組正致力于肺癌CTC單細胞的相關研究，通過基因組測序技術，分析肺癌CTC異質性，深入探究肺癌發生、發展、轉移及耐藥的機制，為肺癌精準醫療提供新的思路。

綜上所述，CTC檢測作為一種液態活檢技術有望克服臨床肺癌診斷低的難題，CTC檢測有助于肺癌分期、轉移預測、治療方案選擇及預后評估。應用微流控芯片技術可實現高效的、高特異性的CTC檢測。CTC捕獲后的單細胞測序分析可從分子水平揭示肺癌的本質，深入探討肺癌發生、發展、轉移及耐藥的機制，從而制定個體化治療方案，實現肺癌精準醫療。