常用的酶
1.辣根過氧化物酶（HRP）：目前酶聯免疫吸附試驗中應用最廣泛的標記用酶。由無色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅蛋白（輔基）結合而成的復合物。輔基是酶活性基團，而主酶則與酶活性無關，HRP的純度用RZ（HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值）表示，RZ值應大于3.0。
RZ值僅說明血紅素基團在HRP中的含量，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高，RZ值與酶活性無關。
酶活性以單位U表示：即1分鐘將1μmol底物轉化為產物所需的酶量。酶變性后，RZ值不變但活性降低，因此使用酶制劑時，酶活性單位比RZ值更為重要。
2.堿性磷酸酶（AP）：大腸桿菌來源的AP分子量80kD，酶作用最適pH為8.0；小牛腸黏膜AP分子量為100kD，最適pH為9.6；后一種AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal來源于大腸桿菌。因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標志物在測定時不易受到內源性酶的干擾，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測定。
常用的底物
1.HRP的底物
（1）鄰苯二胺（OPD）：是HRP最為敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下顯橙黃色，加強酸如硫酸或鹽酸終止反應后呈棕黃色，最大吸收峰在492nm波長。OPD應用液穩定性差，易變色，需新配制后在1小時內使用，顯色反應過程需避光，而且具有致癌性。
（2）四甲基聯苯胺（TMB）：TMB經HRP作用后變為藍色，加入硫酸終止反應后變為黃色，最大吸收峰波長450nm。TMB穩定性好，成色無需避光，無致突變作用，是目前ELISA中應用最廣泛的底物。缺點是水溶性差。
（3）其他：5-氨基水楊酸（5-ASA）和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）。
2.AP的底物
常用對-硝基苯磷酸酯（p-NPP），p-NPP經AP作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物
常用4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高強度熒光物4-甲基傘形酮（4-MU），其敏度性較HRP高30～50倍，但測量時需用熒光計。