體外培養的中腦多巴胺能神經元MPTP損傷模型
l實驗操作：實驗采用胚胎齡14一16天的大鼠，剖子宮取胎，取胎鼠中腦腹側區。可將多個胚胎來源的組織收集在一起，置Fl2培養基（Gibco）至35mm的培養皿中，以細剪刀剪碎。將2ml含0.125％的胰酶的F12加入到組織中，該混合物于37oC孵育10分鐘后，加入DNase I（Sigma）至終濃度80ng／m1，繼續于37oC孵育10分鐘。消化后的組織以尖端被火拋光的移液管輕輕吹打8次。該細胞懸液以種植培養基稀釋（種植培養基： MEM，補充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg／ml谷胱甘肽，10 units／ml青霉素，10ul/ml鏈霉素和7.5％胎牛血清）。細胞然后種植于35mm的預先以10ug／m1 po1y1ysine （Sigma）和2.5ug／ml merosin（Chemicon）鋪底的培養皿中，種植密度為50,000細胞／cm2。培養16小時后，培養基換為無血清培養基。該培養基為F12和basa1Eag1e’s medium，補充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氫鈉，10mM HEPES（pH7.0），1ug／ml谷胱甘肽，20ug/ml胰島素， 100ug/ml轉鐵蛋白， 60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亞硒酸鈉（NaSe），30nM三碘甲狀腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml鏈霉素。
毒物處理：于第4天以1uMMP+處理48小時。然后進行分析。
模型評價：倒置顯微鏡下觀察細胞形態、細胞計數、免疫組化檢測TH陽性細胞的數目和形態。
體外培養的中腦多巴胺能神經元6-OHDA損傷模型
采用上述方法選擇胎鼠，分離中腦腹側部，解剖顯微鏡下仔細剔除腦膜和血管，用高糖T-BSS反復沖洗滌之七遍。并將組織剪碎，移入0.25％胰蛋白酶溶液中，37oC振蕩消化30分鐘，后加入血清數滴終止消化，用吸管輕輕吹打后，加入不含血清的DMEM培養液混勻，1000rpm，10min離心收集細胞，反復2次，后加入含血清的完全DMEM培養液懸浮細胞，過220目不銹鋼篩網使成單細胞懸液，計數后將約3×106個細胞接種人事先涂有多聚賴氨酸的35mm的六孔培養板中，置37oC、5％CO2培養箱中培養。24小時后待細胞完全貼壁時，置換舊培養液，以后每隔2天更換一次培養液。培養至第六天時加入100uM的6-OHDA處理3小時后吸出。在相應備孔中加入完全DMEM培養液洗滌2遍，再加入完全DMEM培養液繼續置5％CO2培養箱中培養24小時，采用與上述相同的方法做免疫細胞化學染色，計數TH陽性細胞，確立6-OHDA對體外培養的多已胺能神經元的損傷作用。