動物組織RNA的提取
實驗目的：掌握由動物組織中提取總RNA的方法
實驗原理：Trizol試劑是一個包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細胞的同時抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA則分布在上層的水相中，最后用異丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗滌沉淀，這樣就可以得到比較純凈的總RNA.
實驗步驟：
① 先在研缽中加入液氮，再將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，用液氮預冷的藥匙取50～100mg組織粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意組織粉末總體積不能超過所用Trizol體積的10%），充分混合均勻。
② 室溫放置5min，然后加入200μl的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15秒鐘。
③ 12000rpm離心10min，取上層水相于一新的EP管中（千萬不要將中間的沉淀層和下層液混入，否則重新離心分離），加入500μl異丙醇，溫和顛倒混勻。室溫放置10min，12000rpm離心10min。
④ 小心地棄去上清液，加入1ml的75%乙醇，渦旋混勻，4℃下12000rpm離心5min。重復操作一次。
⑤ 棄去上清液（盡量將殘余液體除去），室溫或真空干燥5～10min（注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度）。用30μl
DEPC處理過的水將RNA溶解，必要時可55℃～60℃水浴 10min。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
另外，還可以通過試劑盒提取總RNA， 操作步驟見試劑盒說明。
RT-PCR擴增目的基因及瓊脂糖電泳分析
實驗目的：掌握通過RT-PCR方法由真核生物的總RNA中獲得目的基因的方法，并通過瓊脂糖電泳對擴增結果進行定性檢測。
實驗原理：由于真核生物的mRNA的3′端存在 Poly(A)尾，這樣以olig（dT）為引物，在逆轉錄酶的催化下，就可以合成互補DNA（cDNA），然后以cDNA為模板，利用目的基因擴增引物進行PCR就可以擴增出目的基因。
實驗步驟：
RNA的反轉錄
① 在小EP管中依次加入
RNA模板 3 μl
Olig（dT）18引物 1μL
DEPC H2O 8 μL
混合后，70℃水浴5 min（破壞二級結構），再冰浴5min。
② 在管中依次加入 (反應體系為20 μL)：
RT 5×buffer 4μL
RNasin 1μL
dNTP ( 10mM) 2μL
混勻，37℃ 5min。
M-MULV反轉錄酶 1 μL
置于 42℃水浴，1h。
③ 70℃保溫5min（使酶失活）。
④ 于-20℃保存備用。
PCR擴增目的基因
以反轉錄產物為模板，克隆引物B1，B2為引物，利用rTaq酶進行擴增目的基因，用于后續連入克隆載體的操作，然后再以表達引物EB1，EB2為引物，利用Pfu DNA聚合酶進行擴增目的基因，用于后續連入表達載體的操作。
94 ℃ 3 min
94 ℃ 45Sec
30 cycles: 57 ℃ 45Sec
72 ℃ 45Sec
72 ℃ 5min
擴增結果通過瓊脂糖凝膠進行電泳檢測
載體和外源DNA的連接反應
實驗目的：為了實現DNA的體外重組，選擇合適的限制性內切酶，對兩者進行酶切，產生粘性末端，利用T4DNA連接酶將基因片段與載體連接起來，體外構建成重組DNA分子。
實驗原理：
目的片段與T載體的連接反應
利用Taq酶除了聚合功能外，同時具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴增產物的3`端自動添加一個3`-A突出端，而在線性的T載體的5`端存在一個5`-T突出端，這樣在高活力的T4DNA連接酶的作用下，在很短的時間那就能完成連接反應。
目的片段與表達載體的連接反應
已知在載體pGEX
4T-1上存在BamHⅠ和SalⅠ的單一限制性酶切位點，而在擴增目的片段時我們在引物的5`端人為引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，將它們同時進行雙酶切，就可以產生互補的粘性末端。這樣在T4DNA連接酶催化下，載體質粒與目的片段的粘性末端共價結合，環化為重組DNA分子。