實現超濾富集！色譜層析方法達到最好的分離能力

　　50-100KDa的膜截留的超濾技術是早期IgG的純化技術中的難點之一。硫酸聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示，大部分宿主細胞蛋白的分子量要小于該濾膜孔徑，因此，IgG能被有效截留。

　　同時濃縮和更改緩沖液有利于后續優化步驟。正是這一特點使該技術成為捕獲LgG蛋白最合適的候選方法，然而事實上作用效果并沒有達到預期的效果。

　　膜污染后會妨礙后續通過膜過濾而富集蛋白的效果，同時宿主細胞污染物在LgG中的含量會增多。Protein A蛋白親和層系色譜法是目前富集免疫蛋白較好的方法。超濾一般作為蛋白初步純化后的，輔助后續蛋白濃縮和膜滲濾的技術。

　　 目前已知，蛋白A功能有高重復性并具有很高的結合力，但如超濾一樣，要應用于IgG的純化，他必須具有比以往更強的結合傳輸能力才行。在應用于色譜前，蛋白A因其與IgG精準的特異性結合力而備受青睞。大家抱著一種期望，即使用親和層系色譜技術，將蛋白純化一步到位。但是在實際實踐中發現，純化后的蛋白中通常能檢測到濃度為1000-10000ppm的宿主細胞蛋白污染物，且會有DNA殘留。這一結果看上去不太合理，因為蛋白A 可能會與其他物質親和，但實際上并非如此。這些物質的殘留表明，這些污染物替代了IgG，反而與蛋白A結合。目前已知道蛋白A結合技術令人失望主要來源于樣品處理過程中的色譜介質的化學污染。化學污染不同于物理污染，物理污染主要包括一些細胞或者尺寸足夠大的碎片會堵塞濾膜或色譜柱，而化學污染主要指一些污染物與純化介質表面的非特異性化學作用。在細胞培養后的收獲液中，20-40%的宿主污染物結合在由上百種物質組裝成的復雜化合物中。有的結合力比較弱，有些結合力很強，其中某些組分與蛋白A的結合能力比LgG與蛋白A的結合力還要強并能作為一些與色譜介質親和力弱的物質的錨定位點。

　　 色譜表面這些組裝物的堆積會干擾色譜純化作用，主要有以下兩種途徑：其一：50–400 nm 的聚體會堵塞IgG通向色譜柱微粒中的彌散孔道；這與裝載純化后的IgG比，動態負載容量下降量高達20%。隨后IgG的洗脫條件也會使錨定的污染物組分洗脫下來，而這部分洗脫下來的污染物仍會留在IgG組分中。從蛋白A 中洗脫下來的IgG中含有的宿主污染物有99%來源于這一步。

　　化學污染效應不止局限與蛋白A,它會削弱所有的色譜方法，它會使傳統型或多模式型陽離子交換色譜的能力下降50-65%。化學污染甚至會使分子排阻色譜法也舉步維艱，在該純化方法中色譜微粒的化學表面會被鈍化。事實上許多異源結合物與分子排阻色譜有很強的相互作用以至于會造成洗脫圖譜的拖尾而不能嚴格按照聚體分子量的大小實現組分分離。

　　在柱子裝載前消除這些化學污垢會顯著提升柱效：用蛋白A去除宿主細胞蛋白和DNA能夠分別提高100和1000倍的柱效。IgG的結合能力能提高至純化的IgG結合水平。而離子交換色譜和多通道采集甚至能得到更好的效果。

　　借于化學污染能削弱所有色譜分析效果因此提前去除化學污染能夠使色譜分析法達到其最好的分離能力，實現超濾富集，已達到十九世紀八十年代的設想。

　　本文對這些問題進行了詳細的闡述，并做了進一步的探究

　　從細胞培養收集液中去除的主要化學污染物包括：帶強負電荷和正電荷的組分，強疏水性組分，溶解度最大和最小的組分。該方法主要是通過向游離細胞或細胞內含物收集液中添加絮凝劑實現的。尿囊素晶體會通過氫鍵結合聚體，病毒和內毒素；辛酸會聚沉多種宿主細胞蛋白和病毒。帶正點的聚體，微粒，或深層過濾則主要針對DNA，病毒和一些酸性宿主細胞蛋白。去除這些固體顆粒便可以排除40-70%的宿主細胞蛋白，99%的DNA，2-3logs的內毒素，5-9logs病毒和75-95%的聚體。而典型的IgG抗體最多會損失10%，且主要為一些與聚體結合的錯誤折疊的蛋白。其他的方法在文獻中也有探討。

　　圖3 顯示了中國倉鼠卵巢細胞培養收集液絮凝前后的SEC圖譜。那些分子量逐步增長逼近IgG峰的聚體中，包含了錯誤折疊的IgG, 但含量更多的是與染色質成核中心相結合的宿主細胞蛋白。這也說明了為什么不能用超濾法收集LgG。這些具體本應該與IgG一起滯留與它們與孔道相作用的部位，并且處理后與IgG一樣同為滯留物。圖3中右手邊的圖顯示了為什么提前進行絮凝處理能使超濾達到顯著的效果。

　　為捕獲完整LgG蛋白的超濾吸附技術

　　圖4展示了一套基礎的超濾-吸附一體化（流水線）設備。第一個圖框內只顯示了線性處理過程中的超濾系統。圖框2顯示了一體化處理中伴有吸附性色譜的流動路線。除了添加了吸附通道，還添加了一些作用于洗脫或流動相中的特定的吸附劑。圖5 展示了一款擁有兩個吸附通道的早期處理模型。

　　平衡

　　處理前要先平衡系統。平衡緩沖液與吸附色譜藥品裝載條件相同。在這個過程中吸附劑不在工作狀態，但超濾系統一直在線處理。在樣品載入后濃縮和膜滲透同時進行，在這個過程中大部分小分子污染物通過滲透作用被清除。在滯留物被完全平衡前吸附劑開始發揮作用，與吸附劑作用的滯留物隨緩沖液的改變和濃縮過程也一直在系統中循環。當緩沖液條件與平衡條件達到一致時，該處理過程結束。

　　整體柱和吸附膜

　　吸附色譜可以分為整體柱、吸附膜或特定的色譜柱。整體柱和膜與選擇性類似物吸附柱相比，每單位體積與蛋白結合能力較低。但超濾這一步驟減小了對容量的需求，同時整體柱和膜在較高的流速下比柱子有更好的結合效率。因為在集成處理中，需要有較大過濾面積和較快流速以得到較為合理的處理時間，因此，在集成化處理中整體柱和膜更有使用價值。

　　整體柱和膜有更好的使用介質也是被優先選擇的一個原因。因為兩者都是對流傳質，因此只需一步傳遞過程便可實現飽和。對流傳質效率不受流速和溶質的大小的影響。有多空微粒的特定色譜柱主要靠樣品在孔道中的彌散，而彌散效率也主要取決于流速和溶質的大小。這很好的解釋了為什么單步傳質載入不能是色譜柱飽和，而必須采用多步載入。

　　暫不考慮其低效，色譜柱在蛋白的純化中仍不失為一個重要的方法。因為它比整體柱和膜有更多的配基可供選擇，尤其是包含多種類型的吸附劑。而其線性流速這一短板也因為軸向和流向的較短的柱床得以彌補。多孔道微粒色譜柱的另一個優勢即它可以根據分離物所需的容量需求定制與之相匹配的柱子。

　　圖7顯示的為赫賽汀類似物的實驗結果。其中化學污染物已如前文所述，經過尿囊素、辛酸、帶正點的微粒和深層過濾等方法提前清除。所用緩沖液為pH8.0，濃度為50mM的Tris。抗體經過實驗處理濃度能達到20g/L。當濃度達到2.5DV后加入吸附劑，達到5DV時處理過程結束。處理過程為4-7小時，處理后宿主細胞蛋白含量低于37ppm，DNA含量低于1ppd，聚體含量約為0.1%，回收率為86%。

　　表一結果顯示了同一細胞系用不同污染物去除方法，不同的超濾介質和不同的吸附劑處理后的的收獲液的實驗結果。簡言之，30KDa的纖維素膜和50KDa的PES膜的處理效果基本相同。100kDa級的膜對這種抗體會造成一定的損失，但可能會適用于其他類的抗體。整體柱，吸附膜和多孔道微粒色譜柱可互相代替。強離子交換吸附劑和弱離子吸附可互為替換。多模式陽離子交換吸附劑與苯基膜可互為替代。

　　當然這并不是說該技術適用于所有吸附劑和抗體。應用于其他抗體時，用不同的吸附劑處理效果也會有不同。但是在左右情況中，污染物的去除效率對處理效果的影響最為顯著。若不進行污染物的處理會導致最常見的失敗，即宿主細胞蛋白濃度會達到10000-30000ppm。

　　蛋白單獨捕獲后的超濾吸附處理

　　圖8 簡要概括了蛋白A在洗脫液pH3.5時進樣的一種純化方法。在弱陰離子交換整體柱中進行循環富集時，在緩沖液濃度達到50mM EMS，pH為5.5時，富集濃度能達到25g/L。一種0.22-μm 過濾膜置于整體柱前，以除去pH調整過程中一些物質引起的濁度變化。事實上，有一種抗體是一個罕見的例外，盡管提前處理去除了污染物，但經過蛋白A處理這一步驟后，純化的此蛋白中仍會含有>2000ppm的宿主細胞蛋白。但協同超濾-吸附方法，仍能將宿主細胞蛋白、DNA 和聚體分別降到10ppm、1ppd和0.1%以下。

　　該方法能將宿主細胞蛋白從2000將到10ppm最大的兩個亮點在于：其一，通過暫停裝置使純化過程暫緩，先去除污染物進而使純化效果能達到其本來應有的效率；其二，保證整個流動處理過程中超濾通道一直發揮作用，以去除整個循環過程中一些小分子污染物。因為能去除系統中的非吸附性污染物，因此該方法對流動處理結果的優化有極其重要的作用。相比之下，非吸附性污染物在傳統的流穿色譜中仍會殘留在抗體中。

　　協同多步色譜層析處理

　　協同單一吸附通道的流穿法是最令人感興趣的：這種方法只消耗更少的流動相和更少的處理時間，但可以在單一設備上添加額外的吸附通道來完成多步純化。

　　對于有兩個流穿通道的設備來講，處理過程與平衡和濃縮同時進行。第一個吸附通道開啟并一直保持到樣品平衡結束。之后關閉第一個吸附通道，啟用第二個吸附通道。第二個系統用去除污染物效果最佳的緩沖液平衡。然后用潔凈的緩沖液沖洗系統以置換流路中的產品，最后用0.1M的NAOH對系統進行消毒。

　　在結合-洗脫過程中使用吸附劑會消耗跟多的緩沖液和更多的時間但同時也能得到濃度更高的產品。并且該方法跳過了處理過程中流動相更換的難題。一旦你所需的蛋白進入系統中，便與吸附過程同步更換緩沖液。大分子量的非IgG蛋白，例如IgM和VIII 因子，尤其是血管假性血友病因子表明他們是天然的超濾透析分子，因為它們可以自發調整膜以適應更大孔道的分布，對更多污染物有消除潛力。

　　病毒顆粒也是疫苗，基因靶向治療和抗生素的重要代替物。圖9簡要說明了兩通道設備對噬菌體的純化。處理過程主要包括濃縮和與平衡至50mM,pH6.0的平衡過程同步進行的去污過程，之后產品再結合到陽離子交換整體柱上。陽離子交換完成后關閉程序，再開啟陰離子交換整體柱。流動相調整至50mM HEPES，pH7.0，在此條件下病毒結合，之后在進行洗脫。

　　未來的方向

　　生物制藥行業的不斷發展對協同超濾-吸附技術能否實驗蛋白純化這一理想提出了明顯的質疑。答案是肯定的，但是要用一種完全不同于以往的技術，例如SMB色譜技術，該項技術是真正意義上的連續處理：它以產品成產的速率來不斷處理產品，并連續不斷的傳輸處理后的產品。但是該技術在一臺設備上只提供一種色譜方法，多種設備只能用多部處理才能進行。每臺設備包括數十種移動部分，每天協調上千種處理項目。方法開發需要極其復雜的模擬軟件在多種柱子上模擬非直觀的逆向色譜活動。

　　超濾-吸附一般用于批處理，但是也可支持在單一設備上完成純化的全過程。在單步處理時，可在處理前和處理后對系統的所有部件進行消毒。一個簡單的緩沖缸來收集循環中獲得的收集液便可實現全天連續性生產。甚至每個系統都為多個吸附步驟進行了配置，包括只有一個部分的活動部件和SMB所需的監測設備以及每個處理過程中所用到的較少的設備。開發主要涉及建立直觀概念和熟悉相關的指導原則。

　　所需設備是超濾-吸附系統應用的一個限制，以至現在還不能實現商業應用，但部分組間已用于商業化使用本文探討的數據來源于整合了切向流動過濾裝置的商業化數據，同時進行了適當修改使其包含整個線上處理中所需要UV、pH和傳導器數據。幾十年來這些被應用于各種規模的產品處理過程中，由于具備色譜介質，因此數據的可測量性不再是問題。而一個經驗豐富的色譜工程師能在短短幾小時內裝配好一套功能完整的基本設備。

　　未來是否會有或者說企業何時才能引入新的儀器技術，這是很難預測的，但是一些關鍵的技術現已明朗：超濾技術完全可以滿足企業創辦者初期期望的處理效益。而且我們確定比起已知的傳統技術，我們能更高效率的使用它。近年來化學行業和儀器的發展已把我們帶入到一個空前的階段去使用這些設備區做蛋白純化工作。日益增長的生產力和經濟需求正仰仗于工業的發展，同時我們期待的機遇需求可能正隱匿于此文中。