SYBR Green I 在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質，通過熔點曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，因而可以、區分非特異擴增，進一步地還可以實現單色多重測定。此外，由于一個 PCR 產物可以與多分子的染料結合，因此 SYBR Green I 的靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響 1 。由解鏈曲線來分析產物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結果。
2．分子信標（molecular beacon）
分子信標是一種在靶 DNA
不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此發夾結構中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結構中，熒光基團被激發后不是產生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（
FRET ）。由于 " 黑色 "
淬滅劑的存在，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑，其釋放能量的波長與熒光基團的性質有關。分子信標的莖環結構中，環一般為
15-30 個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般 5-7
個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致于在復性溫度下，模板不存在時形成莖環結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，它發出自身波長的光子（圖
5 ）。
圖 5. 分子信標工作原理
3．TaqMan 探針
TaqMan 探針是多人擁有的ZL技術。 TaqMan
探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的 5’
末端，而淬滅劑則在 3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與 3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的
5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA
聚合酶（ MJ Research 公司有售）。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。
圖 6. Taqman 探針工作原理
4. LUX Primers
LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物 3’ 端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發夾結構，使熒光淬滅。在沒有目標片斷的時候，引物與模板配對，發夾結構打開，產生特異的熒光信號（如圖 7 ）。
圖 7.LUX 引物工作原理
與 Taqman 探針和分子信標相比， LUX 引物通過二級結構實現淬滅，不需要熒光淬滅基團，也不需要設計特異的探針序列。因為 LUX 引物是一個相對較新的技術，所以其應用還有待實踐的檢驗。
實時熒光定量 PCR技術的應用
實時熒光定量 PCR 技術是 DNA 定量技術的一次飛躍。運用該項技術，我們可以對 DNA 、 RNA 樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外我們還可以對 PCR 產物或樣品進行定性分析：例如 利用熔解曲線分析識別擴增產物和引物二聚體，以區分非特異擴增；利用特異性探針進行基因型分析及 SNP 檢測等。 目前 實時熒光 PCR 技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：
1. DNA 或 RNA 的絕對定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的檢測 , 轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測， RNAi 基因失活率的檢測等。
2. 基因表達差異分析。例如比較 經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及 cDNA 芯片或差顯結果的確證
3. 基因分型。例如 SNP 檢測，甲基化檢測等。
隨著實時熒光定量 PCR 技術的推廣和普及，該技術必然會得到更廣泛的應用。