多光子顯微鏡成像技術：大視場多區域腦成像技術

為了了解神經回路的功能以及神經元之間的相互作用,需要對不同區域的大量神經元進行活體成像,我們這里介紹兩種顯微鏡技術,分別針對大視場多區域成像和自由活動小鼠的活體成像。

從圖1可以看出用于視覺處理的神經元分布在直徑約3毫米的區域——小鼠初級視覺皮層和多個較高級的視覺區域。當前的商用雙光子顯微鏡系統通常提供約0．5mm的視場(FOV),僅能對一小部分區域的神經活動進行成像(圖1A), 而且它們僅能使用單束激光對單個區域進行成像。所以想要詳細了解小鼠視覺皮層區域神經元的活動,需要開發視場大于3mm(圖1B),并且能夠同時進行多區域成像的雙光子顯微鏡(圖1C)。

圖1 小鼠大腦的視覺區域[1]

文獻[1]開發了大視場、雙路徑掃描的雙光子顯微鏡系統(DIESEL2p),FOV大于5mm,兩束獨立的激光同時在兩個不同的區域采集圖像。圖2是DIESEL2p裝置圖,光源是鈦寶石激光器(80MHz、910nm),激光首先通過單棱鏡進行預啁啾,在分開兩條路徑之前,經過一個自適應光學模塊,包括兩個變形鏡,用來動態校正一些殘留的光學像差。

接著激光被偏振分束器分向兩條路徑;在路徑2中,通過延時光路將路徑2的激光束相較路徑1延遲6．25納秒,來建立時分復用;兩條光路都包括一個x共振型振鏡,一個x檢流計振鏡,一個y檢流計振鏡和光繼電器,每條掃描光路都可以獨立于另一條掃描光路進行任意可變的光柵掃描。在兩條掃描光路之后,兩個分離的光束再通過偏振分束器合并。

圖2 DIESEL2p裝置[1]

該課題組展示了DIESEL2p系統的兩個主要的功能:大視場成像和多區域成像。圖3為DIESEL2p系統對小鼠的大腦組織在5毫米乘5毫米視場下進行成像,視場達到5毫米乘5毫米,同時保持神經元尺度的分辨率。

圖3 小鼠大腦組織的大視場成像[1]

圖4為利用DIESEL2p進行同步雙區域成像的結果。兩條光路同時進入皮膚不同區域,均覆蓋1．5毫米乘5毫米的視場,且均設置每秒3．85幀的成像速率。圖中可以清晰分辨每個神經元通過的兩種路徑以及神經元的活動。

圖4 小鼠大腦組織的同步多區域成像[1]

DIESEL2p不僅可以獨立地進行雙路徑成像,而且可以以不同的方式完成它們,比如路徑1進行大面積、低速率成像,而路徑2進行小面積、高速率的成像。系統中的兩條路徑也可以重疊,路徑1的掃描面積較大,而路徑2的僅對路徑1的子區域進行成像。

該系統還可以通過重新定位兩個或多個子區域之間的路徑增加成像的區域,例如,路徑1可以在兩個單獨的區域之間交替,而路徑2可以在另外兩個單獨的區域之間交替,因此可以對四個分開的區域進行成像。最后,該系統不僅可以對路徑進行光柵掃描,還可以進行隨機訪問成像。如圖5,路徑1進行標準光柵掃描,路徑2可以在感興趣的區域進行隨機訪問成像。

圖5 小鼠大腦組織的同步多區域成像[1]

文獻[2]提出了一種寬場結構照明顯微鏡,它通過一個光纖耦合的顯微鏡頭對自由活動的小鼠的腦組織神經元進行成像。為了了解大量神經元的活動,在對小鼠進行活體成像時,當前的熒光顯微鏡技術對小鼠頭部進行固定會阻止小鼠的部分自然行為,而在成像過程中,使清醒的小鼠減少限制自由活動,對理解其行為至關重要。所以需要制造緊湊的小型成像系統,小鼠頭部配有微型顯微鏡,可進行實時成像,通過減輕小鼠頭部固定的負擔,它承受的壓力較小,就可以自由活動。該工作提出了一種寬場結構照明顯微鏡,通過一個微型、小質量的光纖耦合的顯微鏡頭進行成像。

根據阿貝成像原理,許多光學成像系統是一個低通濾波器,物平面包含從低頻到高頻的信息,透鏡口徑會限制高頻信息通過,只允許一定的低頻通過,因此丟失了高頻信息會使成像所得圖像的細節變模糊,降低分辨率。對于三維成像來說,寬場照明時得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,同時還包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息干擾,常規熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。

三維結構光照明顯微鏡能夠提高分辨率、獲得層析圖像,是因為利用特定結構的照明光能引入樣品的高頻信息,當結構光的空間頻率足夠高時,只有靠近焦面的部分才能被結構光調制,超出這一區域,逐漸轉變為均勻照明,也就是只有焦面附近的有限區域具有相對完整的頻譜信息,離焦后,高頻信息迅速衰減,所以使用高頻結構光照明可以區分焦面和離焦區域來獲得層析圖像。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像,重建樣品的三維結構。

實驗裝置如圖6所示,非相干LED光源波長為470 nm,數字微鏡器件(DMD)生成結構照明條紋,控制相干光纖束(CFB)入射面的照明空間模式。然后,空間圖案通過光纖束再通過光纖耦合顯微鏡(FCM)聚焦到樣本上,左下圖即是穿過光纖束的結構照明條紋圖案示例。樣品發出的熒光通過CFB收集,經過二向色鏡和濾波片最終成像到CMOS相機上。

圖6 實驗裝置[2]

微型光纖耦合顯微鏡(FCM)的具體結構如圖7。FCM中集成了一個微型電潤濕可調透鏡,用于深度掃描,通過施加特定的電壓,電濕潤透鏡內部兩種液體之間的相互作用會改變激發的焦點。并且由于電潤濕透鏡內部兩種液體的密度相似,不會受到運動和振動的影響,因此非常適合用于清醒的動物。FCM在組織中的視場為215微米,軸向總掃描范圍為250微米。

圖7 光纖耦合顯微鏡(FCM)[2]

為了驗證該成像系統的功能,該課題組對小鼠的固定腦切片進行了深度成像(圖8),使用FCM分別獲得了寬場和結構照明下海馬神經元的圖像,樣品處的照明圖案的空間頻率為65．1 mm-1。與寬場相比,重建的SIM圖像有相同或更好的信噪比。通過調節施加到電潤濕透鏡上的電壓在厚組織中進行了深度掃描成像,在不同軸向焦平面上的圖像重建,可以產生4．9 ?m的光學切片。總的來說,該課題組發展了一種寬場結構照明顯微鏡它通過一個微型、小質量的光纖耦合顯微鏡頭對自由移動的小鼠進行深腦體積成像,并且光纖耦合顯微鏡內部裝有電潤濕可調透鏡,可以實現無機械軸向掃描。

參考文獻:

[1] Che-Hang Yu et al．, “Dual independent enhanced scan engines, large-field two photon microscopy (DIESEL2p), paper SW4P．3, CLEO2020

[2] C． Sanchez et al．, “Widefield fluorescence optical sectioning microscopy in a miniature fiber-coupled microscope with active axial scanning,” Paper SW4P．4, CLEO2020