材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
無二價陽離子的磷酸緩沖液（PBS）
酶及緩沖液
胰酶-EDTA 溶液
核酸與寡核苷酸
DNA
用于轉染的質粒 DNA 制備見本方案階段 1, 步驟 10~12。
用作對照的質粒載體（步驟 3)
培養基
含 10% 熱滅活胎牛血清的 Dulbecco's modified Eagle's 培養基（DMEM)
離心轉頭
Sorvall H1000B 轉頭或等同規格轉頭
專用設備
電穿孔轉染設備以及 0.4 cm 寬的電轉染槽
組織培養平皿（100 mm)
寬口加樣器頭
細胞與組織
COS-7 細胞
細胞須在含 10% 熱滅活胎牛血清的 DMEM 培養至 75%—85% 致密。關于細胞的處理細節，包括胰酶消化，見 Spector 等（1998b)。
方法
1. 用無二價陽離子的 PBS 洗滌單層 C0S-7 細胞。通過胰酶-EDTA 處理將細胞從平皿表面消化下來。4°C、250 g(Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1100r/min) 離心 10 min 回收細胞。
重要：在整個過程中須保持 COS-7 細胞處于預冷狀態。
關于細胞胰酶消化細節見 Spector 等（1998b)
2. 將用于轉染的 DNA 樣品溶于無二價陽離子的 PBS 并調整至 100ul。
轉染所需的 DNA 量應按第 16 章，方案 5 進行優化，
3. 用 700ul 無二價陽離子的 PBS 重懸 4X106COS-7 細胞。在預冷的電轉染槽中混合細胞與 DNA(槽內寬 0.4 cm)。將混合物放置冰上 10 min。
PBS 體系中如含二價陽離子，將導致電轉染時產生電弧，可破壞電穿孔僅。
確保應用空載體 DNA 進行電轉化，作為實驗對照。
4. 小心重懸細胞，按 1.2kV(3kV/cm) 和 25uF 進行電穿孔轉染實驗。迅速將電轉槽重置于冰上，并放置 10 min。
電穿孔轉染條件按第 16 章，方案 5 描述的方法進行優化。
5. 用寬口加樣器頭將 1x106 的電轉染后的細咆轉入 100 mm 的組織培養平皿中，每個平皿已加入 10 ml 預熱至 37°C 的含 10% 熱滅活胎牛血清的 DMEM 培養基。在設定 37°C、5%~7%CO2 及一定濕度的培養箱中培養 48~72 h。
階段 3:mRNA 的提取
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
DEPC 處理水
乙醇
NaCl(5mol/L)
酚
酚：氯仿
無二價陽離子的磷酸緩沖液（PBS)
SDS(5%m/V)
TMK 緩沖液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
10 mmol/LKCl
1 mmol/LMgCl2
Triton X-100(10%V/V) 或 Nonidet P-40(4%，V/V)
離心轉頭
Sorvall H1000B 轉頭或等同規格轉頭
專用設備
細胞刮子或橡膠刮
聚苯乙烯離心管（15 ml), 冰上預冷至 0°C
細胞與組織
分別經重組 pSPL3 和非重組 pSPL3 轉染的 COS-7 細胞
方法
1. 用冰預冷的不含鈣、鎂離子的 PBS 洗滌平皿中的轉染 COS-7 細胞三次。洗滌過程中將平皿保持在冰上。
2. 每個平皿中加入 10 ml 預冷的 PBS。保持平皿在冰上，小心的將細胞刮除下來。
3. 將細胞懸液轉入預冷的 15 ml 聚苯乙烯離心管中。
使用透明的聚苯乙烯離心管，有利于步驟 8、9 中不含細胞核的胞漿的回收。
4.4°C、300 g（Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1200r/min) 離心 8 min 回收細胞。
5. 盡可能傾去上清，并用加樣器除去殘存的上清。
6. 在 300ulTFK 緩沖液中重懸 1X106 至 2x106 的 COS 細胞，冰上放置 5 min。
7. 加入 15ul 的 10% 的 Triton X-100 或 4% 的 Nonidet P-40, 冰上放置 5 min。
加入非離子去污劑可導致質膜的輕微破解而核膜保持完整。
8.4°C、500 g(Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1500r/min) 離心 5 min 沉淀細胞核。
9. 將上清移入預冷的 1.5 ml 小離心管中。
重要：移取上淸時應異常小心，切不可觸及細胞核沉淀。如核膜破裂會導致基因組 DNA 污染，樣品將非常黏期而難以吸取。
10. 加入 20ul 的 5%SDS 和 300ul 的酚，劇烈振蕩后最大速度離心 5 min，樣品將分為有機相和水相。
11. 將水相移入含 300ul 酚: 氯仿的 1.5 ml 小離心管中，劇烈振蕩后室溫最大速度離心 3 min 進行分相。
12. 移取上層的水相至預冷的 1.5 ml 小離心管中，加入 120 的 5mol/LNaCl 和 750ul 的乙醇。-20°C 放置 2~3 h 或-80°C 放置 30 min 以沉淀 RNA。
核酸在乙醇中比在水中更穩定。如長期保存，RNA 應置于乙醇中-80°C 凍存（見第 7 章，方案 1 結尾部分的專欄“RNA 的保存"）。
13.4°C、最大速度離心 10 min 回收 RNA。
14. 棄上清并用 70% 乙醇洗滌沉淀。空氣干燥后，將沉淀重懸于 20 g 的 DEPC 處理水中。
階段 4: 反轉錄 PCR
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液
10x 擴增緩沖液
氯仿
DEPC 處理水
DTT(lmol/L)
dNTP 溶液，每種核苷酸濃度為 1.25 mmol/L
酚
RNase 抑制劑
酶及緩沖液
Bst XI
EcoR V
Mo-MLV 反轉錄酶
Taq DNA 聚合酶
DNA 尿嘧啶糖基酶（1 單位/ul)