基因敲除(gene knockout ) 是 80年代初出現的一項新的基因工程技術, 是制備轉基因動物的重要技術之一。利用該技術可以培育先天缺陷某一特定基因的動物, 以此研究該特定基因的生理功能或在疾病發生發展中的意義。近年來基因敲除小鼠在藥物依賴性研究中也得到廣泛的應用。在傳統的藥物依賴性研究中, 往往選取特異性的受體配體來研究該受體在依賴性中的作用, 但這種特異性往往是相對的 ,劑量改變就可能影響其它受體的功能,所以難以真正確定該受體的作用。而基因敲除技術在這方面具有獨特的優點, 因為利用基因敲除技術可以選擇性敲除某一特定受體基因, 獲得先天缺陷該受體基因的小鼠,通過比較基因缺失動物(本文簡稱 KO型) 和野生型動物(本文簡稱 WT 型) 在依賴性模型上的行為差別 , 可以準確判斷該受體所發揮的作用。可以說, 基因敲除技術的發展為藥物依賴性研究帶來了一場新的革命。本文綜述了近年來這一方面的研究進展。
1 基因敲除技術簡介[1 ]
基因敲除是通過人為干預達到抑制或滅活目的基因表達的分子生物學技術。它采用同源重組方法(homologous recombinat ion)用突變的基因刪除(取代)相應的正常基因, 或用正常基因敲除相應的突變基因, 從表達水平或轉基因動物的表現型來研究正常基因的功能和突變部位的作用。利用基因打靶 (gene target ing) 技術獲得基因敲除動物是其中的一種方法, 其步驟是使胚胎干細胞內的目的基因進行定點突變 (基因打靶) , 將打靶后已定點突變的胚胎干細胞注射到宿主胚泡中, 再將胚胎植入假孕母體的子宮內,使其發育成目的基因缺陷 (突變) 的雜合的種系嵌合體, 將其自交后再篩選出目的基因缺陷型的純合子即基因敲除動物。通過分析基因敲除動物體內單基因缺陷所產生的表型異常來研究基因調控和功能, 建立疾病的動物模型以及進行基因治療等。
2 敲除阿片受體基因
阿片受體是阿片類物質直接作用的受體, 不僅在介導阿片類鎮痛中發揮重要作用, 而且也與精神活藥物物的依賴性有關。阿片受體分為μ、δ和κ等幾種亞型,目前 ,已經培育了μ、κ和δ受體缺陷的小鼠 ,為研究μ、κ和δ受體在藥物依賴性中的作用提供了很好的實驗模型。
2. 1μ阿片受體
μ受體基因敲除小鼠, 其后代符合孟德爾遺傳規律, 28. 6 %野生型, 46. 6 %雜合子, 24. 8 %的純合子 , 說明突變的μ受體基因缺陷小鼠沒有發生宮內和出生后死亡。這種小鼠的生長、發育、生殖和活動周期等與正常小鼠無明顯差異。放射配體結合實驗顯示 ,μ受體 KO 小鼠沒有任何μ受體存在,但δ和κ受體的數量和分布未受影響[2 ]。
藥物是選擇性較高的μ阿片受體激動劑, 其對WT小鼠有很強的鎮痛作用, 但在μ受體 KO小鼠不出現鎮痛。在浸尾、甩尾和熱板法鎮痛試驗中,對μ受體KO小鼠皮下注射藥物達到 50 mg·kg- 1,鞘內或腦室內注射藥物劑量達到WT小鼠鎮痛ED50的15倍都不產生鎮痛作用。表明μ阿片受體基因編碼的受體對介導藥物在痛通路中的作用是必須的。在同樣實驗條件下,藥物在κ、δ受體KO小鼠仍有鎮痛作用, 證明了κ和δ受體不參與介導藥物鎮痛。用條件性位置偏愛方法評價藥物的欣快效應證明藥物(3 mg·kg- 1sc)在 WT 小鼠產生 CPP 效應 ,而在μ受體 KO 小鼠不能引起 CPP 效應。慢藥物物給藥使 WT 小鼠形成身體依賴性, 納洛酮誘發其出現戒斷癥狀, 同樣處理μ受體 KO 小鼠不出現戒斷癥狀。重復藥物給藥使 WT 小鼠腦內腺苷酸環化酶的活性上調, 而在μ受體 KO 小鼠腦不產生腺苷環化酶活性上調 [3 ], 說明藥物產生的精神依賴性和身體依賴性是μ阿片受體介導的, μ阿片受體基因編碼的產物是藥物藥理效應的既定的分子靶位。
2. 2κ阿片受體
κ受體 KO 小鼠的自發活動與 WT 小鼠無差別。κ受體激動劑 U50488H 在κ受體 KO 小鼠不引起鎮痛作用 , 也不形成條件性位置厭惡效應, 而在WT 小鼠出現,表明κ受體在κ激動劑作用中的重要性。藥物在κ受體 KO 小鼠的鎮痛作用和條件性位置偏愛效應與 WT 小鼠無差別, 但藥物的戒斷癥狀則明顯弱于 WT 小鼠, 說明κ受體不參與藥物的鎮痛和獎賞效應, 但參與調節藥物的身體依賴性[4 ]。
2. 3δ阿片受體
在δ阿片受體基因敲除小鼠,δ受體激動劑DPDPE 的鎮痛作用在脊髓水平明顯減弱, 但在脊髓上水平的鎮痛作用與野生型無差異, 說明δ受體在不同部位的鎮痛效應中所起的作用不一樣。實驗還發現δ受體敲除小鼠不對藥物的鎮痛作用產生耐受性 [5 ], 但δ受體敲除小鼠在依賴性中的作用還有待于進一步研究。
3 敲除多巴胺受體或多巴胺遞質轉運體基因
多巴胺 (DA) 系統是藥物精神依賴性的神經基礎, 中腦邊緣DA 系統是“獎賞系統”中最重要的一環。DA 受體亞型有兩類: D1 樣 (D1 和D5 受體) 和D2樣(D2、 D3 和D4 受體) ,不同的DA 受體亞型在藥物獎賞中發揮的作用也不相同。利用基因敲除技術已經培育出了D1、 D2、 D3、 D4 受體缺陷的實驗小鼠,為探討DA 受體在藥物獎賞效應中的作用提供了依據。
3. 1 D1 受體
D1 受體 KO 小鼠基礎性活動多于 WT 小鼠。可卡因能使 WT 小鼠活動增加,而不能使D1 受體 KO小鼠活動增加, 但可卡因的位置偏愛效應在兩種小鼠都出現[6 ]。苯丙胺反復給藥的行為敏化現象在D1 受體 KO 小鼠低于 WT 小鼠; 苯丙胺在D1受體KO小鼠和WT小鼠都形成自身給藥, 但 KO 小鼠的陽性反應率低于 WT 小鼠[7 ]。這些實驗說明D1 受體激活可能是可卡因、苯丙胺運動增強效應所必需的,而不是獎賞效應所必需的。但這與正常 WT 型的實驗結果不一致, 因為在正常鼠, D1 受體拮抗劑可抑制藥物的自身給藥和偏愛效應。造成這種不一致的原因可能與受體拮抗劑的特異性有關, 也可能與基因敲除小鼠的遺傳異常有關。