| 實驗步驟 |
1. 選擇 pH 范圍，計算緩沖與滴定 Immobiline 的體積
對未知樣品 pH
范圍的選擇，最好先用寬范圍（如 pH 3.5~10 ) 載體兩性電解質等電聚焦確定其等電點的位置，再選擇窄范圍的固相 pH
梯度等電聚焦。確定范圍后，根據表 7.4 和 7.5 査得或進一步用內插法計算得到緩沖和滴定 Immobiline 的體積。
2. 貯液配置
丙烯酰胺單體貯液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉雙丙烯酰胺在 35 ml 雙蒸水中，攪拌直至溶解，用雙蒸水加至 50 ml。過濾，溶液可在 4℃ 保存兩周。
40% (W/V) 過硫酸銨貯液：溶解 0.4 g 過硫酸銨在 1 ml 雙蒸水中。溶液必須新鮮配置。
Immobiline II：使用前將貯存在 4~8℃ 冰箱中的 Immobiline II 溶液在室溫平衡約 0.5 小時。
3. 模具組裝和凝膠溶液的配置
如
“水平平板電泳的制膠” 組裝灌膠模具，但不需要在模具上做加樣孔。如欲灌注 T=5%、C=3% 的凝膠，參見表 7.4，表 7.5 和表
7.6。凝膠溶液必須新鮮配置。一般將酸性 Immobiline 作為重液，堿性 Immobiline 作為輕液，俗稱
“酸重堿輕”。如欲提高電泳速度，可加 100 μl 載體兩性電解質。
4. 灌膠
固相
pH 梯度的灌膠模具可使用與常規聚丙烯酰胺梯度凝膠和 SDS 梯度凝膠灌膠相同的模具，參見 “水平平板電泳的制膠”
。但不需要做加樣孔，并且不需要有濃縮膠和分離膠之別。作者實驗室曾灌注 pH 4.4~5.4 固相 pH 梯度膠用于分析 Gc 蛋白亞型和 pH
5.05~5.60 固相 pH 梯度凝膠用于分析轉鐵蛋白。
(1) 灌膠前梯度混合器的腔間閥和流出管的夾子都應關閉。
(2) 將 7.5 ml ( 視凝膠大小而定）輕液（堿性）注入梯度混合器的儲液腔。小心打開腔間閥，趕去腔間氣泡，再關上腔間閥。若不慎有輕液流入混合腔，則需將輕液吸回儲液腔。
(3) 將同樣體積的重液（酸性）注入梯度混合器的混合腔。在兩個腔中分別放入同樣大小的攪拌子，在儲液腔中放入補償棒，此時兩腔液面應該相平。
(4) 將梯度混合器置于磁力攪拌器的最佳位置上。將流出管插入灌膠模具中央。為了控制流速，得到線性梯度，梯度混合器的出口與流出管末端高度相差約 5 cm。開動磁力攪拌器（200~500 r/min)。
(5) 在兩個腔中各自先加 TEMED，再加過硫酸銨。打開流出管的夾子，當酸液流到流出管的一半時，打開腔間閥。兩腔中液面同時下降，在混合腔混合后，緩緩注入垂直放置的模具中。
(6) 灌注完畢后，在室溫靜置 5~20 分鐘（可用異丙醇封膠 )。放入 30~40℃ 烘箱中聚合。灌膠后，立即洗凈梯度混合器，以免堵塞腔間閥。
5. 洗膠和吹膠
凝膠聚合約需
1 小時，從烘箱中取出凝膠模具后，同 “薄層分析等電聚焦的方法” 方法取出凝膠，標上正、負極。稱重后放入雙蒸水中（6X10 分鐘或 3X1
小時 )，室溫下振搖約 60 次/分鐘，洗去催化劑和未聚合的單體。洗膠后，用軟紙吸去表面的水。用冷風（小電扇）在一定距離約（50 cm )
吹膠至與洗膠前重量相差小于 1%。如果凝膠中含有過多水，影響膠濃度和梯度，在電泳時易在凝膠表面形成水滴，改變導電性干擾聚焦。小于 pH 8
的凝膠至多可保存一周，堿性膠不宜保存。
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