固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗7

對于分離寬分子量范圍的蛋白質，梯度 SDS-PAGE 凝膠可提供最佳分析方法，產生更清晰的蛋白質點。通過減少凝膠中孔的尺寸，可使擴散減少。但是，梯度凝膠重復性較差，所以通常用多凝膠灌制裝置來同時灌制，制作一套凝膠來進行同一系列的實驗。下面講述用多凝膠灌制系統灌制梯度凝膠的方法。

如果凝膠要用銀氨方法（方案 11) 來染色，凝膠中的硫代硫酸鈉可減少染色背景（HochstrasserandMerril,1988; 見表 4.6 注釋）。

過硫酸銨（10%)正丁醇乙醇4X凝膠緩沖液凝膠儲存液單體膠儲液SDS (10%)5XSDS 電泳緩沖液TEMED蔗糖

玻璃平板梯度制備儀磁力攪拌子磁力攪拌器多梯度凝膠灌制盒蠕動泵吸管夾子隔片真空瓶水抽真空泵或其他抽真空系統

1.安裝玻璃板之前，用乙醇浸過的無棉紙巾擦拭玻璃板，確保無灰塵顆粒粘在玻璃板表面。

實驗提不：處理玻璃板的過程中要戴手套，以減少角蛋白和其他蛋白的污染。

2.對齊兩塊玻璃板，在兩邊放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔板。

3.用不脫色的記號筆標記玻璃板距上沿 0.5 cm 處，在一些系統例如 Bio-Rad ProteanII，玻璃板不等長，應確保標記距短板上沿0.5 cm。

4.用打字機或鉛筆標記一小條濾紙作為凝膠的標簽。將濾紙放在凝膠框的左邊底部。不要用記號筆，因其會滲人凝膠。

5.將整個凝膠框放人多凝膠灌注架中，同樣將其他的凝膠框排列放于灌注架上，用薄塑料片（即隔板）將各凝膠框分隔開。這些薄片通常由多凝膠灌注架提供，但也可用聚酯薄膜板切割而成。用灌注架提供的隔板填充各個空格。夾緊灌注架上前面的玻璃板以確保墊片將灌膠空間密封好。

6.灌膠之前，向灌膠的空間加水來確定所需試劑的體積，測量體積的一半用于制備低（輕溶液），另一半用于制備高（重溶液）。用表 4.6 來計算灌膠中各個成分的體積。

7.制備準確體積的輕、重丙烯酰胺溶液，過硫酸銨與 TEMED 的體積忽略不計，各加一個小的磁力攪拌子。

8.用水抽真空泵來抽去丙烯酰胺中的氣體（幾分鐘），同時在磁力攪拌器上攪拌。

雖然并非所有研究者都進行這步抽真空，但為了更佳的重復性，建議進行此步操作。

9.當溶液在抽真空時，將一根管子連到蠕動泵，先用水檢驗以確保制造商所建議泵的流速。一旦流速固定，將管一端連在梯度混合器的出口，另一端連到多塊凝膠灌注儀的人口。在多塊凝膠灌制裝置的開口端放一個夾子，打開夾子，確保梯度混合器處于關閉的狀態。

10.在混合器中將小磁力攪拌子放人，將梯度混合器放在磁力攪拌器上。