固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗11

在方案 11 中介紹的銀氨方法是用于檢測在 SDS-PAGE 凝膠上蛋白質的最靈敏的方法之一。但是，這種方法和其他標準銀染方法都不適合于質譜分析，而質譜已成為鑒定雙向凝膠上蛋白質的最好方法。因為在凝膠中被質譜分析的蛋白質不能被修飾，許多通常用的敏化試劑（例如戊二醛和強氧化劑）不能使用。而且，研究者發現購買專用試劑盒有很多優點，因為其中的試劑質量對完成銀染是有保證的。這樣的試劑盒可從不同公司購得，如 Amersham Biosciences、Bio-Rad、Piece 等化學試劑供應公司。此處介紹的方法是基于 Yan 等描述的 Amersham Biosciences Plus One 銀染試劑盒 (2000b)。他們發現這個方法適合 MALDI 和 ESI-MS 質譜，與其他銀染方法（包括方案 11 中敘述的方法）相比，此法可處理少量制備樣品且沒有負染色效果。但是，這個過程與標準銀染法相比靈敏度不夠高。與 MS 兼容的銀染方法，見 Shevchenko 等（1996)、Scheler 等（1998)、Gharahdagh 等（1999) 和 Sinha 等（2001)。

包含蛋白質樣品的凝膠

顯色液固定溶液敏化溶液銀染溶液終止液

塑料紙或細長的聚碳酸酯塑料薄片玻璃或塑料平皿往復式或定軌式搖床

1.將凝膠放在含 250 ml 固定液的平皿中，在搖床上搖動 5 min。如果有多塊凝膠要固定，應在單獨的平皿中染色。

2.從平皿中排盡固定液，用方形塑料紙或聚碳酸酯薄片支持凝膠。不允許戴手套的手直接和凝膠接觸。再加 250 ml 固定液，繼續搖 15 min。

3.棄去固定液，在平皿中再次加人 250 ml 敏化液，在往復式或定軌式搖床上搖動 30 min。

4.從培養皿中排盡固定液，在平皿中用方形塑料紙或聚碳酸酯薄片支持凝膠，加足夠董的去離子水來覆蓋凝膠。在搖床上搖動凝膠 5 mm。

5.排盡水，重復水洗 2 次以上。

6.在步驟⑦之前 30?60 min 制備銀染溶液。

對 4 個標準大小的凝膠，IL 銀染溶液是足夠的。

7.排盡平皿里的水，支持凝膠在平皿中用方形塑料紙或聚碳酸醋薄片。在每個平皿中加 250 ml 銀氨溶液在往復式或定軌式搖床上搖 20 min，搖動時間可縮短至 15 min。如有必要，應至少 15 min，不超過 20 min。

8.將銀氨染色溶液倒人一個合適的廢物缸中，確保不用戴手套的手接觸凝膠。

9.加足夠的水來覆蓋凝膠。在搖床上搖 5 min。

10.排盡水，將第一次洗液倒入盛有硝酸銀的廢物缸。重復用 H2O 洗 2 次以上。

11.當洗凝膠時，制備顯色液和終止液。將終止液放在易操作的位置以避免顯色和終止之間的延遲。

12.從平皿中排盡水，在平皿中用方形塑料紙或聚碳酸酯薄片支持凝膠。在培養皿中加 250 ml 反應液。在放有白紙的搖床上搖動。

白紙可提高被染色蛋白和背景之間的反差，提高決定反應終止點的準確度。

實驗提示：一次不要同時顯色 3 塊以上的凝膠。準備顯色凝膠之前在 H2O 中保存其他凝膠。合適的顯色時間隨每塊膠的不同而不同。單獨觀察凝膠決定顯色終止的合適時間。當蛋白質點出現黑色或小的蛋白質點變明顯時，這一時間是較合適的。第一個蛋白質點出現約需 lmin。注意不要過度顯色。合適的時間通常約為 5~lOmin。

13.當凝膠充分顯色后，將顯『色液倒人合適的廢物缸內。在平皿中用方形塑料紙或聚碳酸酯薄片支持凝膠，快速將 250 ml 終止溶液倒人平皿中，在搖床上搖動 IOmin0

14.棄去終止液，用 H2O 覆蓋凝膠，在搖床上搖動 5 min。

15.倒掉水，重復水洗 2 次以上，準備對凝膠進行掃描分析或質譜分析。

實驗提示：Gharahdaghi 等（1999) 曾報道，在凝膠消化前，脫色以除去銀顆粒可能會提高質譜的效果。