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  • 發布時間:2019-09-12 11:10 原文鏈接: 哺乳動物DNA的快速分離

               

    實驗方法原理 根據本方案制備的哺乳動物 DNA 約 20~50 kb,適于作 PCR 反應的模板。DNA 產量在 0.5 到 3.0 μg/mg 組織之間變化,或者是 5~15 μg/300μl 全血。
    實驗材料

    無 DNase 的 RNase 蛋白酶 K 哺乳動物組織或全血

    試劑、試劑盒

    細胞裂解緩沖液 乙醇 異丙醇 醋酸鉀溶液 紅細胞裂解緩沖液 TE

    儀器、耗材

    連有真空管的抽吸裝置 微量離心研棒 水浴

    實驗步驟

    一、材料

    1. 緩沖液及溶液

    細胞裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA ( pH 8.0),0.1%(m/V) SDS)

    乙醇

    異丙醇

    醋酸鉀溶液(60 ml 的 5 mol/L 醋酸鉀,11.5 ml 冰醋酸,28.5 ml 水)

    紅細胞裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)

    TE ( pH 7.6)

    2. 酶及緩沖液

    無 DNase 的 RNase ( 4 mg/ml)

    蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

    3. 專用設備

    連有真空管的抽吸裝置

    微量離心研棒

    預先調到 55℃ 或 65℃ 的水浴

    4. 細胞和組織

    哺乳動物組織或全血

    二、方法

    1. 準備用于分離 DNA 的組織或全血

    (1) 組織

    ① 切下 10~20 mg 組織。

    ② 用剃刀或解剖刀切碎組織或者將組織冷凍于液氮中,用在液氮中預冷的研缽研磨成粉。

    (2) 血液

    ① 在兩個微量離心管中分別轉移 300 μl 全血樣品。每管中加入 900 μl 紅細胞裂解緩沖液,蓋上蓋子,顛倒混勻。溶液于室溫下放置 10 min, 中間顛倒混勻幾次。

    ② 室溫下用最大轉速離心 20 s。

    ③ 每管保留 20 μl 上清,棄去其他部分。

    ④ 用剩余的少量上清重懸白細胞沉淀。將兩管中的沉淀合成一管。

    2. 將切碎的組織或者重懸的白細胞沉淀轉移到加有 600 μl 冰冷的細胞裂解緩沖液的離心管中。用微量研棒迅速研磨 30~50 下,混勻懸濁液。

    3. (可選擇的)向裂解產物中加入 3 μl 蛋白酶 K, 以增加基因組 DNA 的產量。消化液置于 55℃ 放置 3 h 以上,但不要超過 16 h。

    4. 消化液降至室溫,然后加入 3 μl 4 mg/ml 的無 DNase 的 RNase。37℃ 放置 15~60 min。

    5. 將樣品降至室溫。加入 200 μl 醋酸鉀溶液,劇烈振蕩 20s 使其充分混合。

    6. 用最高轉速 4℃ 離心 3 min, 使蛋白/SDS 復合物沉淀出來。

    7. 將上清轉移到加有 600 μl 異丙醇的新離心管中。充分混合,然后用最大轉速室溫下離心 1 min 收集 DNA 沉淀。

    8. 吸去上清,加入 600 μl 70% 的乙醇。顛倒管子數次,用最大轉速室溫下離心 1 min。

    9. 小心吸去上情,空氣中干燥 DNA 沉淀 15 min。

    10. 將 DNA 沉淀溶解于 100 μl TE ( pH 7.6)。

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