雙波長分光光度法是在傳統分光光度法的基礎上發展起來的,它的理論基礎是差吸光度和等吸收波長。在單位時間內有兩條波長不同的單色光以一定的頻率交替照射同一吸收池的溶液,然后經過檢測器和電子控制系統,計算出這兩個波長下吸收度的差值△A,與被測定物質的濃度成正比。
它與傳統分光光度法的不同之處,在于它采用了兩個不同的波長即測量波長(又叫主波長λp, Primary Waelength)和參比波長(又叫次波長λs, Second Waelength)同時測定一個樣品溶液。以克服單波長測定的缺點,提高了測定結果的精密度和準確度。
早期的雙波長分光光度計在測定時,兩束不同波長的單色光經斬光器(Chopper,一種用于雙波長分光光度計中使光束按一定周期反射,遮斷或通過的裝置)處理后,以一定的時間間隔交替照射比色杯,經待測溶液吸收后,再照到光電管上,產生兩個不同的吸光度,再將這兩個吸光度相減,就得到了差吸光度ΔA。