（四）雜交后處理（post hybridisation treatment）
雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學的實驗程序中，這也是一個重要的環節 。特別因為大多數的原位雜交實驗是在低嚴格度條件下進行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強了背景染色。RNA探針雜交時產生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結合，從而增強了背景染色。放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測背景染色（非特異性標記的多少）作為改善漂洗程序的指針。在35S標記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸鹽（thiosulphate），以防止35S標記的核酸探針被氧化。總之，如何控制漂洗的嚴格度從而達到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復的實踐中取得經驗。
（五）顯示（Visualization）
顯示又可稱為檢測系統（Detection system）。根據核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統進行不同顯色處理（詳見本章 第二節 ）。
細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer – assisted image analysis）檢測銀粒的數量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數量的核酸的顯色強度進行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。
（六）對照實驗和ISHH結果的判斷
和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設置須根據核酸探針和靶核苷酸的種類和現有的可能條件去選定，常用的對照試驗有下列幾種（表20-1）。
表20-1 ISHH對照試驗一覽表
| 核乳膠或非放射性檢測系統對照試驗 |
| Northern 或Southern印跡雜交法* |
| ISHH與免疫細胞化學結合* |
| 應用多種不同的核苷酸探針與同一靶核酸進行雜交 |
| 將cDNA或cRNA探針進行預雜交（吸收試驗）* |
| 與非特異性（載體）序列和不相關探針雜交（置換試驗） |
| 將切片應用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交* |
| 應用同義RNA探針（Sense probe）進行雜交* |
| 以不加核酸探針雜交液進行雜交（空白試驗） |
| 組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行ISHH對照 |
| 應用未標記探針做ISHH，進行對照 |
從理論上講，對照試驗設置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應任選設至少3～4種用以證實ISHH結果的可靠性。在上述試驗中，標明*者為比較可靠的對照試驗。①Northern 和Southern印跡雜交法證明的方式和用Western印跡法檢測抗體（蛋白質）的特異性一樣，是比較可靠的。②如果具備相當的免疫組化抗血清，可用結合的免疫組織化學和ISHH法從蛋白質（或多肽）水平和轉錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。③預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結果應為陰性。④由于同義RNA探針和組織內mRNA序列順序是相同的，應用其進行ISHH，結果應為陰性。檢測系統的對照如乳膠或酶顯色系統也應在無標記探針的情況下進行。
ISHH的最大優點是它的高度特異性，它可測定組織、培養的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的放射性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由于雙鏈DNA的穩定性，在用ISHH定位DNA時很少發生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結果的解釋應持慎重態度，特別是前人未報告過的新發現。因為如前所述，影響ISHH實驗結果的因素太多，比如在外科或實驗取材后未及時的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導致假陰性結果。另外，在各種類型核酸探針進入細胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結果。
第二節 cRNA探針在原位雜交組織化學（ISHH）中的應用
Angerer及其同事們首先應用RNA探針于原位雜交（見Cox et al 1984），核酸探針為單鏈的RNA分子，產生自具有質粒逆轉錄系統的cDNA克隆（圖20-2）。由于它是單鏈的，不像雙鏈的DNA探針，在溶液中不會再退火（reanneal），因此，較大百分比的探針可參與雜交反應，較cDNA探針的信號強。除此之外，在溶液中產生的cRNA-mRNA雜交體比相應的cDNA-mRNA雜交體穩定，但在原位雜交中是否如此尚未證明。cRNA探針不足之處在于有時比DNA探針粘性強（stickier）。可與組織產生較高的非特異性結合，但此缺陷可在雜交后漂洗液中加用酶漂洗來解決。最近，Wolf等（1987）建議插入確定長度的寡核苷酸至載體內產生cRNA分子，這種cRBA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”（oligoribo－probes）已被成功的用于原位雜交實驗。
圖20-2 示cDNA轉錄為cRNA，可標記以不同的標記物，然后與細胞中
的mRNA相結合。Biotin(生物素)，Au(金)，digo-（地高辛）
一、同位素標記cRNA探針在ISHH中的應用
（一）組織切片的原位雜交細胞化學方法
（1）組織準備：大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g 體重），或1%戊巴比妥鈉約1ml（3～4mg/100g體重）腹腔內注射麻醉，用100ml生理鹽水沖洗和150ml 4%多聚甲醛主動脈灌注固定。固定半小時后，取出組織塊，置入4%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。
如要取腦組織，可于灌注后置4℃冰箱內過夜，次晨取腦組織，后固定4℃4h左右。
（2）組織切片/培養細胞在經過處理，抹以粘附劑的載片上，在43℃烤箱過夜。
（3）在PBS（0.1mol/l Ph7.2）中浸5～10min。
（4）浸于0.1mol/L甘氨酸—PBs 液內5min。
（5）為增強組織通透性，將載片置于0.3%Triton X-100(在PBS內)10～15min。
（6）PBS洗3×5min。
（7）在蛋白激酶K（1μg/ml）溶于Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA（50mmol/L,pH8）中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。
（8）浸入新鮮配制的4%多聚甲醛（在PBS0.1mokl/L,pH7.2）3min以終止消化作用和再固定。
（9）浸入新鮮配制的含0.25%（V/V）三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0）中，10min以達乙酰化（acetylate）的目的。
（10）預雜交：在50%（V/V）甲酰胺溶于4×SSC預熱37℃15～45min 。
（11）雜交：將載片上過量的甲酰胺液傾去，加20μl雜交混合液（含放射性同位素標記的探針量為5×103～106cpm/每張載片）。覆以硅化的蓋玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒內以保持濕度，42℃孵育12～18h。為使載片不致于浸泡于SSC溶液內，通常以二根玻管（或棒）扎成擔架狀，載片置于玻棒上，與鹽液不接觸，但可保持盒內空氣濕潤。
（12）雜交后漂洗
①以小燒杯盛適量4×SSC溶液，將載片一端斜插入溶液內，輕輕抖動以移除蓋玻片。
②將載片置于有刻度的染色用小方玻缸內，加入42℃（預熱）4×SSC，3×20min。在漂洗過程中宜不斷振動，以增強漂洗效果。如設有調整鈕的振動臺更為理想。
③加20μlRNA酶溶液（20μg/ml）在NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和EDTA（1mmol/L,pH8.0）消化未雜交探針，42℃30min（也有不加EDTA的）。
④以遞減梯度鹽溶液SSC漂洗載片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。
⑤梯度酒精脫水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室溫，每次10min，空氣干燥后待進行放射自顯影。
（13）放射自顯影和復染
①在暗室中預熱水浴至45℃，將分裝的核乳膠溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同時預熱一電熱板至45℃。將雜交后漂洗過完全干燥的載片依次排列于玻片架上，有組織切片一面面向實驗者。在實驗的載玻片前放1～2張無切片的干凈玻片，作為測定核乳膠溶解度與浸片高度等的空白對照片。浸泡（Dipping）過核乳膠膜的載片放入暗盒內，事先最好將暗盒準備好，為保持干燥，放入一包變色硅膠干燥劑（無水干燥劑為小塊藍色晶體，吸水后呈粉紅色，置烤箱中烘干待轉成藍色后可重復應用），預先備好封固暗盒用的膠帶備用。
②核乳膠液，國外產品為ILFord K5乳膠液，國內核乳膠產品可自原子能研究所訂購。不論國產或進口乳膠，事先應（按說明需要濃度）稀釋分裝在10ml小瓶內，密封于暗盒內，4℃備用。反復的冷凍和融解核乳膠會增加背景染色。每一小瓶供一次性實驗應用。
為節 省核乳膠，切片宜貼附在靠近載片的一端。這樣，在浸泡時少量乳膠便可充分覆蓋切片。
③浸核乳膠（Dipping）：當一切準備工作就緒后，在暗室中（只留完全燈）先將載片置于電熱板上預熱1～2min。以空白載片浸入核乳膠液，取出后檢查核乳膠是否充分溶解，玻片上有無氣泡。然后正式進行切片浸入。浸核乳膠膜是一項需反復操練的技術。以拇、食指夾住玻片一端，以垂直方向進入乳膠，進入的提出均應采取中速度，且速度應保持穩定，提出后可將玻片一端滴下的乳膠輕沾于吸水紙上，掌握好該技術，浸入形成的核乳膠膜厚度適當，均勻一致。依序放在預熱45℃的電熱板，傾斜度應一致。在45℃電熱板上干燥至少1～2h，在此期間應嚴格控制在黑暗中。
④裝入暗盒曝光：將載片架上已干燥覆有核乳膠的載片放入暗盒內，周圍用膠帶封固，以標簽寫明：樣品種類，實驗者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱內。曝光時間依同位素種類而異，32P大約需5～7日，3H需4周，但還要參考細胞內mRNA的含量而定，含量高者曝光時間宜短，反之宜適當延長。可根據不同曝光時間的實驗結果予以調整。曝光時間長可增加信號，但也增加背景，反之，信號減弱，但背景亦低。
⑤顯影：取出切片中暗盒（注意：切勿啟封），放在室溫至少1h，使其回升到室溫。然后在暗室內（只留安全燈），將載片置入Kodax D19顯影液（預調溫至18～20℃）3min。水沖片刻后入Kodax F24固定劑內3min。上述溶液及水溫最好都保持在18～20℃。突然改變溶液溫度會損壞精細的核乳膠膜。另外，在顯影和定影過程中不要振蕩溶液，因為，這時的乳膠還是處于膠狀結構，溶液振蕩的沖擊可使乳膠膜產生劃痕。
⑥沖洗，脫水和復染：用自來水（水沖力勿過猛）沖洗載片20min，如需要可用1%蘇木精復染，復染后自來水沖洗分化2min，梯度酒精脫水（70%，90%，100%）每次3min，二甲苯透明，DPX封片。
（二）培養細胞的原位雜交細胞化學方法
（1）固定：通常將細胞培養在蓋玻片或塑料薄膜上，可將蓋玻片取出，傾去培養液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依組織切片處理法進行ISHH實驗。也有在4%多聚甲醛室溫固定20min后，由低濃度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鮮配制的70%酒精中，4℃，備用。
（2）重回到水：50%，30%酒精3min，無菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/l MgCl2 10min，室溫（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl2）。
（3）0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室溫10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，應用重蒸水制成200ml）。
以后步驟同（一）組織切片法。