原代細胞的培養與建系

　　凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經特殊分離方法制備而來的原初培養的細胞稱之為原代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術是細胞培養工作的基礎。

　　原代細胞的取材

　　人和動物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養。

　　一、取材的基本要求

　　1．取材要注意新鮮和保鮮

　　2．應嚴格無菌

　　3．防止機械損傷

　　4．去除無用組織和避免干燥

　　5．應注意組織類型、分化程度、年齡等

　　6．作好記錄

　　二、各類組織的取材技術

　　皮膚和粘膜的取材 內臟和實體瘤的取材血液細胞的取材

　　骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材動物組織取材

　　人胚體組織取材

　　雞（鴨）鳥類胚胎組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材

　　皮膚和粘膜的取材

　　主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般 2~4 平方厘

　　米。

　　內臟和實體瘤的取材

　　內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。

　　血液細胞的取材

　　血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等）分離細胞，取材時應注意抗凝。

　　骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材

　　嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無鈣、鎂 PBS 洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。

　　動物組織取材

　　1、鼠胚組織取材

　　首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有 75%酒精的燒杯中，5 分鐘后（注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力），取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材， 采用無菌操作法解剖取出胚胎。

　　2、幼鼠胚腎（或肺）取材

　　幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，

　　然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。

　　人胚體組織取材

　　取材方法與鼠類相同

　　雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟

　　（1） 取孵化至適當胚齡（9~12 天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。

　　（2） 將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用 75%酒精棉球擦干；

　　（3） 經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；

　　（4） 用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；

　　（5） 用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

　　原代細胞的分離和制作

　　人或動物體內（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個細胞在體外培養中生長繁殖，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來。

　　一、懸浮細胞的分離方法

　　組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘。經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。

　　二、實體組織材料的分離方法

　　對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液， 可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。