單核細胞增生性李斯特菌 (L.monocytogenes)屬于李斯特菌屬(Listeria), 是一種人獸共患的病原菌,能引起人和多種動物共患的李斯特菌病。李斯特菌在自然界廣泛存在,食品中存在的單核細胞增生性李斯特菌對人類的安全具有危險, 并被列為 21 世紀對中國人衛生健康具有重大影響的 12 種病原微生物之一。因此,在食品衛生微生物檢驗中,必須加以重視 。本文對當前李斯特菌感染的實驗室檢測方法進行總結,以供研究參考。
1.傳統的細菌分離鑒定
國家標準中EB增菌法和LB增菌法,通過微生物的分離培養、生化反應、溶血試驗、協同溶血試驗、動物試驗等進行分離鑒定。實驗設備要求不高,可操作性強,但檢驗周期長,需6-7d。這種傳統的檢測方法已無法滿足食品生產過程中的在線檢測、食品上市和消費前的快速檢測的要求。
2. 免疫學檢測
免疫學方法是基于抗體、抗原的天然密切關系, 只需少許樣品純化就可以精確檢出抗原, 不易受基質影響, 并且可以提供實時信息。 目前已有的檢測方法諸如酶聯免疫吸附劑測定 ( ELISA )、 酶聯熒光分析法 ( ELFA)、同位素標記抗體法 (放射免疫 )及其它多種方法, 如乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散及免疫色譜技術等。這些方法具有操作簡便、快速的特點。但由于單克隆抗體費用昂貴,所以用ELISA盒進行多種食品樣品的檢測費用較高。
3. 分子生物學檢測
近十年來以分子生物學為基礎的檢測方法迅速發展起來, 諸如 DNA探針、 PCR(聚合酶鏈反應 )和 DNA芯片 (DNA microarray)等方法都得到了廣泛應用。
3.1 PCR檢測方法
用于PCR檢測的特異引物, 一種是依據單增李斯特菌的特異毒力基因序列設計, 常以hlyA、iap、inl、Dth-18作為靶序列。Graham等用16S/23 SrRNA基因中間保守區域進行PCR擴增,對單增李斯特菌的特異性進行了研究,為檢測提供了依據。王海艷等根據單增李斯特菌的hly基因和李斯特菌屬的l6R NA基因各設計了一對引物,用兩對引物組合建立了PCR方法來檢測人工污染的食品,檢測限最低達1 cfu/25g。
金大智等采用實時熒光PCR技術對單增李斯特菌進行了快速檢測。方法是用Taq酶切斷探針,產生熒光信號。結果能測出李斯特菌屬的各個血清型,靈敏度較高。Bhagwat等用多重PCR可以同時檢測單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和E.coli O157:H7。Dunbar等用生物素標記引物,通過熒光方法來、分析PCR產物,大大縮短了檢測時間。Choi和hong用hlyA基因序列為靶模板進行競爭PCR,在沒有增菌的情況下可以在5h內測出103cfu/0.5mL的牛奶樣品。
3.2 全自動微生物分析系統檢測
國內外現在已有很多全自動微生物分析系統問世,如Vitek系統、Biolog系統 、Midd系統、Sensititre系統、Autosceptor系統及Mocroscan系統。其中BITEK-AMS的微生物鑒定系統已被國際分析化學協會( AOAC)列為法定分析法。
展望
隨著學科的交叉, 食源性致病菌的檢測一方面向綜合的方向發展, 即集多種技術于一體的多功能、全自動化大型檢測儀器不斷出現; 另一方面, 針對單個菌種和菌屬的新型培養基、免疫試劑盒和分子試劑盒也會不斷推向市場。相信隨著對單增李斯特菌的全方位深入了解和認識, 更完美的檢測工具會不斷出現。
參考文獻:
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