| 實驗步驟 | 免疫動物
1. 在進行初次注射前（0 天），先采小鼠血，檢測血清背景抗原的反應性。
2. 使用弗氏佐劑（（明磯或完全/不完全弗氏佐劑；Sigma ) : 有關這些佐劑及其他佐劑的詳述可見 Vogel 及 Powell (1995 )的評述）乳化抗原（最佳劑量為125 μg/小鼠；小劑量抗原可與鎖眼型血藍蛋白素（KLH，Sigma ) 進行耦聯，以增加其抗原性），或按 1 : 10 與明礬混合旋振抗原，經腹腔將抗原分 3 次接種（免疫）A /J 或 Balb/c 小鼠，接種劑量如下：
3. 在第 35 天時采小鼠血，用 ELISA 法測定血清中抗體的效價。
4. 將血清順序稀釋至1 : 4、1 : 30、直至 1 : 30720。
5. 選擇含最高效價抗原的小鼠，以備融合使用。
6. 在融合前3 天，對相應動物加強免疫，即靜脈注射 10 μg 或者腹腔注射 25 μg 抗原。
骨髓瘤細胞
1. 為了便于操作，選擇周一給予小鼠加強免疫，周四即可進行融合。
2. 用 MEM+ 10 % 胎牛血清 + 氮雜鳥嘌呤培養基培養P3. 653 骨髓瘤細胞（此種背髓瘤細胞系不分泌免疫球蛋白，非常適用于融合反應（P 3. 653細胞 ATCC 有售））。
3. 融合前三天，每天將 P3. 653 稀釋至 3.5X105個/ml。
T 細胞耗竭（depletion)
1. 自血清效價穩定的小鼠采血后，引頸處死。
2. 無菌操作下取出脾臟，放入一個盛有 5 ml 滅菌 D-PBSA 的培養皿中。
3. 用兩個 1 ml 注射器所帶的 23G 針頭小心地撥碎脾臟，不要用力過猛，以免夾帶出大量的成纖維細胞。
4. 將細胞移至一個 15 ml 的錐形管中，使凝塊沉降。
5. 取未聚集成塊的脾細胞，移至一個 50 ml 的錐形管中，用 Unopette 按1:100 稀釋，血球計數板計數細胞。
6. 200 g 離心 8 min。
7. 將細胞沉淀于 0.84% NH4Cl ( 約需 10 ml/脾臟）中制成懸液，置 4 ℃ 15 min，以溶解紅細胞。
8. 在細胞懸液表層鋪加 14 ml 馬血清，然后 450 g 離心 8 min。
9. 在 50 ml TCD ( T 細胞耗竭）緩沖液（（Hank’s液）平衡鹽溶液+10 mmol/L HEPES+0.3 % BSA）中將沉淀再次懸浮，以 200 g 離心 8 min。
10. T 細胞的衰竭。用含抗-Thy 1.2 溶液（在 TCD 緩沖液中加 1 : 500 的抗-Thy 1. 2 , 過濾除菌）將上述細胞沉淀制成終濃度為 1X 107 個/m l 的懸液。
11. 4℃ 靜置 45 min，然后 200 g 離心 8 min。
12. 將沉淀以稀釋后的家兔補體液制成懸液。
13. 37℃ 培養 45 min。然后以 200 g 離心 8 min。
14. 通過臺盼藍染色計數細胞（見方案 22. 1)。B. 細胞回收率應為 30 % ~50 % 。
融合
1. 將骨髓瘤細胞和脾細胞在一個 50 ml 離心管中混合次融合所需的脾細胞最多為 1.2X108 個。將脾細胞與 P3. 653骨髓瘤細胞以 4 : 1 比例混合；即每次融合的 P3. 653 細胞最多為 3X107 個。
2. 細胞懸液以 200 g 離心 8 min。
3. 輕輕彈擊，將沉淀物充分打散，加入 1 ml PEG（PEG ( 聚乙二醇）：于 56°C 水浴中將 10.5 ml PEG 1450 (Sigma) 溶解，加入 19.5 ml 無菌溫熱的 MEM ( pH 為 8.3~8.7) ；充分混合；擰松瓶蓋，融合前平衡 5~7 天），融合時間至少 15 s。
4. 輕柔地振蕩混勻液 75 s ，懸浮細胞。
5. 加入 1 ml SFM（MEM 置于室溫平衡，松開瓶蓋使培養基中的 CO2完全釋出；pH 需為堿性），至少 15 s , 輕搖振蕩 45 s。
6. 加入 2 ml SFM，至少 30 s , 輕搖振蕩 90 s。
7. 加入 4 ml HAT 培養基（基礎培養基，如 MEM 或 RPMI，加 10% FBS 和 20 % 脾細胞條件培養基，與 HAT 儲存液（（10 mmol/L 次黃嘌呤，40 μmol/L 氨基蝶呤，1.6 mmol/L胸苷）：取 1.36 g 次黃嘌呤、729 μl 氨基蝶呤（取自25 mg/ml 儲存液）、0.387g 胸背以及 0.022 g 甘氨酸，溶于4 ml 的 5 mol/L NaOH +26 ml 超純水中。用超純水補至1 L，過濾除菌）混合（稀釋到終末1:100 )），至少 30 s，輕搖振蕩 90 s。
8. 最后，加入 8 ml HAT 培養基，至少 30 s，輕搖振蕩 90 s。
9. 將上述 16 ml 混合液移入一個無菌的 Nalgene 瓶中，瓶中預盛 HAT 培養基 ( 如果以最大量融合細胞，則需預盛 125 ml HAT 培養液，換言之如果該 16 ml 細胞懸液中含有上述第 1 步中提到的最大融合細胞密度的話（即 1. 5X108 個），需要補加 125 ml HAT 培養基，則瓶中總體積為 141 ml，加上第 10 步離心洗滌所需培養基，終體積為 150 ml，細胞濃度為 1X106/ml)。
10. 將 50 ml 離心管用 9 ml HAT 淋洗后，移到瓶中。
11. 將瓶內各成分混勻，將細胞懸液移至消毒的多道盛液池。
12. 使用 12 道加樣器，按 200 μl/孔的量將細胞接種到 96 孔培養皿上，每孔的細胞總數為 2X105/ml。
雜交瘤的篩選
1. 融合 5 天后換液，將原培養基盡量吸去，重新加入新鮮 HAT 培養基（150~200 μl/孔）以維持細胞生長。
2. 每周換液兩次。
3. 融合后兩周，通過 ELISA 法篩査陽性雜交克隆。
4. 再經 48 h ，重新進行 ELISA 檢測，以確定該陽性克隆。
5. 在 96 孔板上劃出兩個孔，將抗體分泌最高的（陽性）雜交瘤細胞克隆移入這兩個孔內，加含 10% FBS 及 HT 的培養基培養。
6. 重新檢測細胞。在一個 24 孔板上擴增培養陽性雜交瘤細胞，在撤去 HT 培養基（用基礎培養基將 100X HT 儲存液（取 0.408 g 次黃嘌呤、0.1161 g 胸苷和 0.0067g 甘氨酸，溶于2 ml 5 mol/L NaOH + 8 ml 超純水中，用超純水補液至 300 ml。過濾除菌）稀釋（同上述H A T 培養基））時，取 2 ml 培養上清進行篩査。此步驟中，應取足量的上清，進行多次重復測定，以確定該抗體是所免疫抗原的特異產物。
7. 于 24 孔培養板分出 4 孔，進行雜交瘤細胞的擴增，并冷凍保存細胞（見方案 20.1)。
8. 于一個 75 cm2 培養瓶中再次擴大培養雜交瘤細胞，之后再次冷凍保存。 展開 |
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