化學發光免疫分析放射免疫分析法有很高的靈敏度，但存在著放射性防護和同位素污染等問題。近年來，許多非放射性同位素標記的免疫分析方法相繼出現。其中，在化學發光反應及抗原
-抗體特異性識別基礎上建立起來的一種新的非放射免疫分析技術--化學發光免疫分析法，由于這種方法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，線性范圍寬，儀器設備簡單，試劑價格低廉，方法穩定、快速等優點，已成為一種重要的非同位素標記免疫分析方法，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測。
化學發光免疫分析包括三大類型：即標記化學發光物質的化學發光免疫分析；標記熒光物質的熒光化學發光免疫分析和標記酶的化學發光酶聯免疫分析。下面以偶合放大化學發光酶聯免疫分析法檢測人血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)為例。
(一) 原理
盡管辣根過氧化物酶(HRP)可以催化Luminol-H２O２反應體系產生化學發光，但由于該體系的檢測靈敏度不夠高，不能滿足酶聯免疫測定的要求。因此，為了提高體系的檢測靈敏度，可將HRP催化H２O２氧化曙紅(Eosin)的反應與該反應產物增強HRP催化luminol-H２O２的化學發光反應相偶合，建立偶合放大化學發光酶聯免疫分析法。這里，酶的活性是基于下列發光反應進行檢測的:
HRP
luminol＋H２O２───→ 產物＋hν
產 物
↑
Eosin＋H２O２ ──────┘
HRP
二) 操作步驟
1. 包被抗體 在每個小試管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300μl用0.05M,PH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋的抗HBsAg抗體，同時設空白對照，置4℃過夜。
2. 洗滌 用抽濾針頭吸干管內液體，加入Tris-HCl- Tween20洗滌3次，每次加2ml，放置3～5min，用抽濾針頭吸干管內液體。
3. 加待檢血清和陽性標準品 用PBS- Tween20緩沖液不同倍數稀釋HBsAg陽性標準品或待檢血清,每管加入300μl。同時設陰性對照;空白對照管只加抗體稀釋液。置37℃孵育2h。
4. 洗滌 同2。
5. 加酶標抗體 用含小牛血清的PBS-Tween20緩沖液稀釋HRP標記的抗HBsAg抗體，每管加入300μl，空白對照管只加用于稀釋酶標抗體的稀釋液。置37℃ 孵育2h。
6. 洗滌 同2。
7. 化學發光測定 給每管加入300μl底物溶液，置37℃保溫20min。犎;后將小試放入LKB-1250 lumimeter中，并置于測量位置，加入300μl 5.0×10－４M luminol。記錄儀記錄化學發光強度。
8. 同時用ELISA方法進行對照，結果測量采用DG3022型酶聯免疫檢測儀。
結果判定
(1) 定性 按下列公式判別陰、陽性:
L樣品－L空白 ┌≥2.1 為陽性
S／N ＝ ──────── ＝ 商│
L陰性對照－L空白 └＜2.1 為陰性
(2) 定量 以不同稀釋度的HBsAg陽性標準品的化學發光強度為縱坐標，不同稀釋倍數為橫坐標，作出劑量反應曲線(標準曲線)，犜r待測樣品中 HBsAg的含量就可由測量的化學發光強度換算得到。
(三) 試劑和器材
1. 試劑
(1) 緩沖液 a. 0.05M, PH9.6 Na２CO３-NaHCO３緩沖液(包被液)
b. 0.01M, PH7.4 PBS-Tween20緩沖液(抗體稀釋液)
c. 0.02M, PH7.4 Tris-HCl-Tween20緩沖液(洗滌液)
(2) 抗體 a. 抗HBsAg抗體
b. HRP標記的抗HBsAg抗體
(3) 抗原 a. 正常人血清(HBsAg陰性對照)
b. HBsAg陽性標準品
c. 待檢血清
(4) 小牛血清
(5) 底物溶液
1.0ml EDTA (1.0×10－２M）
2.0ml Eosin(1.0×10－３M）
1.0ml H２O２(7.5×10－３M) 用三蒸水稀釋到25ml
0.4ml HCl (1.0×10－２M)
0.2ml Tween20 (1％)
Devil luminol 5.0×10－４M
2. 器材
(1) LKB-1250 lumimeter
(2) 隔水式電熱恒溫培養箱
(3) 各種規格加樣器，小玻璃試管，聚苯乙烯珠
(4) 洗瓶、抽濾裝置等
(四) 注意事項
1. 洗滌要徹底，以免因血清中其他來源的過氧化物酶類物質所產生的非特異性反
應，而影響測定結果。
2. 實驗中，應分別設置陽性、陰性、空白對照來控制實驗條件，且每份樣品均應做三個復管，以保證實驗結果的準確性。
3. 為了克服酶標抗體因非特異性吸附而造成的較高本底，可用適量小牛血清加以抑制。
4. 當加入luminol后，迅速產生化學發光并使發光在一秒鐘內達到峰值，犎;后很快衰減到基線水平。因此，只有當小試管置于儀器的測量位置時，方可加入luminol。
5. 底物的加入，是為了增強化學發光強度。但只有當底物分子與酶催化活性中心充分接觸時，反應速度才能加快。當反應進行15min達到平衡時，牷/學發光強度則不再隨時間的延長而變化，且在1h內保持穩定，因此，控制底物與酶反應15min后加luminol進行化學發光測定。