制備克隆實驗

ATP -巰基乙醇 IPTG X-gal 平末端限制酶 連接緩沖液 T4DNA 連接酶 平末端插入物 克隆載體 培養基

FALCON 2059 多聚丙烯試管 37°C 恒溫箱 水浴箱

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

ATP(10 mmol/L)

β-巰基乙醇（可選擇）

IPTG(100 mmol/L，溶于水中）

X-gal(100 mg/ml，溶于二甲基甲酰胺)

2. 酶和酶緩沖液

平末端限制酶（5U), 比如，SrfⅠ限制性內切酶（Stratagene)

連接緩沖液，l0X(250 mmol/LTris-HCl、pH7.5，100 mmol/L 氯化鎂，100mmol/LDTT,200ug/ml BSA)

T4DNA 連接酶（4U)

3. 核酸和寡核苷酸

平末端插入物（100ng/ul)

克隆載體（10ng/ul)

4. 培養基

(1)SOC 培養基（每升用量：20 g tryptone，5 g 酵母提取物，0.5 gNaCl，加水到 900 ml。高壓滅菌。另外，單獨混合好下面物質：2.03 g 氯化鎂，1.2 g 硫酸鎂,3.6 g 葡萄糖，加水到終體積為 100 ml，過濾滅菌。然后加入已涼下來的高壓滅菌過的培基）。

(2)LB(Luria Broth) 球脂平板 [每升用量：lOg NaCl，lOg Bacto-tryptone，5 gBacto-酵母提取物，20 g Bacto 瓊脂。用 5mol/LNaOH 調整 pH 到 7.0。加入去離子水到終體積為 1L。高壓滅菌，然后倒入培養皿中（大約 25 ml/100 mm 平板）]。

(3) 青霉素-新青霉素 LB 平板（20ug/ml 青霉素，80ug/ml 新青霉素）。用來降低衛星菌落的形成。高壓滅菌的培養基冷卻到 55°C, 再加入過濾滅菌的抗生素。

(4) 氯霉素 LB 平板（30ug/ml)。
高壓滅菌的培養基冷卻到 55°C, 再加入過濾滅菌的抗生素。

(5) 可以選做 X-gal/IPTG 平板：若要表型選擇轉化子，向含有適當抗生素的瓊脂平板中加入 20ul X-gal 和 20ul IPTG 溶液，立即搖勻，使它們分布均勻（可能會出現輕微的沉淀）。
不要混合 X-gal 和 IPTG, 因為這些化合物會沉淀。
重要：在涂板前讓平板干燥 15~30 min。

5. 專用設備

FALCON 2059 多聚丙烯試管

37°C 恒溫箱

水浴，預設到 37°C、42°C、65°C

6. 細胞和組織

適當的大腸埃希菌菌株，比如，XLl-Blue(Stratagene)，按照 Sambrook 和 Russe Ⅱ(2001) 所述方法做成感受態，或者去買做好的。

二、方法

1. 連接

（1）在一個高壓滅菌的 1.5 ml 試管中建立 PCR-Script 反應體系，按順序加入如下試劑。

克隆載體（10ng/ul)                                 1ul

連接反應緩沖液，10X                              1ul

ATP(10 mmol/L)                                        0.5ul

Pfu 拋光 PCR 產物插入物*                       1~4ul

Srf I 限制性內切酶（5U)                           1ul

T4DNA 連接酶（4U)                                 1ul

H₂O                                                          補充到 10ul

*對于連接反應，理想的插入物：載體 DNA 值是可變的。對于樣品 DNA, 從 5:1(當用拋光插入物時）到 100：1(當用非拋光插入物時）可能是必需的。用非拋光插入物時需要更大的插入物：載體值，這是因為 PCR 片段兩端都是平末端的機遇很低。對一個特定的插入片段，最好用下面的方程來優化條件：

                                                             pmol 末端/ugDNA=2X10⁶/堿基對數目

（2）輕輕混勻，在室溫溫浴 1~2 h。

（3）65°C 熱處理樣品 10min。

（4）把樣品在冰上保存，準備轉化感受態大腸桿菌。

2. 轉化

（1）在冰上融化感受態細胞。

（2）輕輕攪動混勻細胞，移取 40ul 細胞到一個 15 ml 預冷的 FALCON 2059 試管。

（3）可選做：向 40ul 細菌中加入，疏基乙醇（至終濃度為 25 mmol/L)。

（4）輕輕攪動，置于冰上 10min, 每隔 2 min 輕輕攪動一下。

（5）加入 2ul 已經熱處理過的連接反應產物 DNA(第 4 步，克隆程序）。

（6）置于冰上 30 min。

（7）在 42C 水浴中熱擊 30s。要獲得最高的效率，熱擊時間長短非常關鍵。

（8）把轉化混合物置于冰上 2 min。

（9）加入 450ul 預熱（42°C) 的 SOC 培養基，37°C225~250r/min 振蕩培養 1h。

（10）取出 50~200ul(100ul 是標準用量）轉化好的混合物，用一個無菌的到叉將它們均勻涂布于恰當的抗生素平板上。

可以選做：向 LB 平板中加入一種可以生成色素的底物來檢測重組體；同時參見β-半乳糖苷酶顏色選擇，如下。
如果涂 100ul 振蕩培養物，可以直接把細胞涂布在平板上; 如果涂少于 100ul 轉化混合物，用 SOC 培養基將轉化混合物的最終體積增加到 200ul, 再進行涂板。

（11）將平板在 37°C 培養過夜（大約 16 h)。

（12）選擇白斑進行檢測，不要選那些有輕微藍色或者中心是藍色的克隆。
           含有插入的菌落最初是白色，在平皿中 2~5 天后可能會出現輕微的藍色。