| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ATP(10 mmol/L)
β-巰基乙醇（可選擇）
IPTG(100 mmol/L，溶于水中）
X-gal(100 mg/ml，溶于二甲基甲酰胺)
2. 酶和酶緩沖液
平末端限制酶（5U), 比如，SrfⅠ限制性內切酶（Stratagene)
連接緩沖液，l0X(250 mmol/LTris-HCl、pH7.5，100 mmol/L 氯化鎂，100mmol/LDTT,200ug/ml BSA)
T4DNA 連接酶（4U)
3. 核酸和寡核苷酸
平末端插入物（100ng/ul)
克隆載體（10ng/ul)
4. 培養基
(1)SOC 培養基（每升用量：20 g tryptone，5 g 酵母提取物，0.5 gNaCl，加水到 900 ml。高壓滅菌。另外，單獨混合好下面物質：2.03 g 氯化鎂，1.2 g 硫酸鎂,3.6 g 葡萄糖，加水到終體積為 100 ml，過濾滅菌。然后加入已涼下來的高壓滅菌過的培基）。
(2)LB(Luria Broth) 球脂平板 [每升用量：lOg NaCl，lOg Bacto-tryptone，5 gBacto-酵母提取物，20 g Bacto 瓊脂。用 5mol/LNaOH 調整 pH 到 7.0。加入去離子水到終體積為 1L。高壓滅菌，然后倒入培養皿中（大約 25 ml/100 mm 平板）]。
(3) 青霉素-新青霉素 LB 平板（20ug/ml 青霉素，80ug/ml 新青霉素）。用來降低衛星菌落的形成。高壓滅菌的培養基冷卻到 55°C, 再加入過濾滅菌的抗生素。
(4) 氯霉素 LB 平板（30ug/ml)。
高壓滅菌的培養基冷卻到 55°C, 再加入過濾滅菌的抗生素。
(5) 可以選做 X-gal/IPTG 平板：若要表型選擇轉化子，向含有適當抗生素的瓊脂平板中加入 20ul X-gal 和 20ul IPTG 溶液，立即搖勻，使它們分布均勻（可能會出現輕微的沉淀）。
不要混合 X-gal 和 IPTG, 因為這些化合物會沉淀。
重要：在涂板前讓平板干燥 15~30 min。
5. 專用設備
FALCON 2059 多聚丙烯試管
37°C 恒溫箱
水浴，預設到 37°C、42°C、65°C
6. 細胞和組織
適當的大腸埃希菌菌株，比如，XLl-Blue(Stratagene)，按照 Sambrook 和 Russe Ⅱ(2001) 所述方法做成感受態，或者去買做好的。
二、方法
1. 連接
（1）在一個高壓滅菌的 1.5 ml 試管中建立 PCR-Script 反應體系，按順序加入如下試劑。
克隆載體（10ng/ul) 1ul
連接反應緩沖液，10X 1ul
ATP(10 mmol/L) 0.5ul
Pfu 拋光 PCR 產物插入物* 1~4ul
Srf I 限制性內切酶（5U) 1ul
T4DNA 連接酶（4U) 1ul
H2O 補充到 10ul
*對于連接反應，理想的插入物：載體 DNA 值是可變的。對于樣品 DNA, 從 5:1(當用拋光插入物時）到 100：1(當用非拋光插入物時）可能是必需的。用非拋光插入物時需要更大的插入物：載體值，這是因為 PCR 片段兩端都是平末端的機遇很低。對一個特定的插入片段，最好用下面的方程來優化條件：
pmol 末端/ugDNA=2X106/堿基對數目
（2）輕輕混勻，在室溫溫浴 1~2 h。
（3）65°C 熱處理樣品 10min。
（4）把樣品在冰上保存，準備轉化感受態大腸桿菌。
2. 轉化
（1）在冰上融化感受態細胞。
（2）輕輕攪動混勻細胞，移取 40ul 細胞到一個 15 ml 預冷的 FALCON 2059 試管。
（3）可選做：向 40ul 細菌中加入，疏基乙醇（至終濃度為 25 mmol/L)。
（4）輕輕攪動，置于冰上 10min, 每隔 2 min 輕輕攪動一下。
（5）加入 2ul 已經熱處理過的連接反應產物 DNA(第 4 步，克隆程序）。
（6）置于冰上 30 min。
（7）在 42C 水浴中熱擊 30s。要獲得最高的效率，熱擊時間長短非常關鍵。
（8）把轉化混合物置于冰上 2 min。
（9）加入 450ul 預熱（42°C) 的 SOC 培養基，37°C225~250r/min 振蕩培養 1h。
（10）取出 50~200ul(100ul 是標準用量）轉化好的混合物，用一個無菌的到叉將它們均勻涂布于恰當的抗生素平板上。
可以選做：向 LB 平板中加入一種可以生成色素的底物來檢測重組體；同時參見β-半乳糖苷酶顏色選擇，如下。
如果涂 100ul 振蕩培養物，可以直接把細胞涂布在平板上; 如果涂少于 100ul 轉化混合物，用 SOC 培養基將轉化混合物的最終體積增加到 200ul, 再進行涂板。
（11）將平板在 37°C 培養過夜（大約 16 h)。
（12）選擇白斑進行檢測，不要選那些有輕微藍色或者中心是藍色的克隆。
含有插入的菌落最初是白色，在平皿中 2~5 天后可能會出現輕微的藍色。 |
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