介紹
蛋白質的內源熒光主要來源于芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。在水中，色氨酸的最大激發光波長在270-280nm左右而其發射光波長峰值接近350nm。蛋白的發射光譜對溶劑的極性和外界環境十分敏感。當蛋白質變性時，色氨酸殘基會暴露在水中而其發射波長會變長。這種發射波長峰值的改變可以用來檢測蛋白質的變性。在這里，我們將展示如何運用SpectraMax?iD3多功能微孔板讀板機檢測內源色氨酸熒光。色氨酸標準曲線用來顯示檢測方法的高靈敏性，而色氨酸發射峰值的偏移則用溶菌酶變性實驗來檢測。溶菌酶包含有兩個色氨酸殘基，因此受到紫外光照射時會發射熒光。當溶菌酶降解時，色氨酸的發射光峰值會偏移6-10nm。我們可以對降解前后的溶菌酶進行熒光光譜掃描來捕獲和檢測發生的峰值偏移。SpectraMax? iD3多功能微孔板讀板機兼具內源色氨酸熒光檢測所需的高靈敏度和波長掃描能力。另外，SoftMax? Pro 軟件可以通過Spectral Optimization Wizard自動識別最最佳的激發和發射波長，同時自動計算發射峰值的偏移，并用于后續分析。
方法
我們預先準備了起始濃度為100 μM的色氨酸樣本并進行了倍比稀釋。將原濃度和稀釋后的樣本按照每個樣本三復孔（每孔200微升）的方式加入至UV高透的96孔板中。在六個空白孔中加入PBS作為對照來計算檢測的最低限值 (LLD)。SoftMax Pro軟件的Spectral Optimization Wizard用來優化獲得最佳激發和發射光波長。通過波長優化后的結果，我們可以準確檢測到色氨酸的倍比稀釋關系。我們用終濃度為5 M 的鹽酸胍處理10mg/mL的溶菌酶溶液使之變性，然后我們用SpectraMax iD3 讀板機對變性前后的溶菌酶樣本進行光譜掃描，其激發光為270nm而發射光在300nm到450nm之間。運用SoftMax Pro Software中預先設定的程序可以自動識別發射光峰值。
材料
? SpectraMax iD3 多功能微孔板讀板機
(Molecular Devices cat. #ID3-STD)
? L-色氨酸 (Sigma cat. #T-0254)
? 溶菌酶 (Sigma cat. #L6876)
? 鹽酸胍 (Sigma cat. #G7294)
? UV高透的 96孔板
(Greiner cat. #655801)
? 磷酸鹽緩沖液 (PBS), pH 7.4）
結果
利用SoftMax Pro軟件的Spectral OptimizationWizard可以將激發光和發射光波長做優化(圖1)。這一特征可以使這些波長的測量有最優的信噪比(激發光波長285nm，發射光波長345nm)。通過波長的最優化方式，SpectraMax iD3讀板機可以準確的測量色氨酸的標準曲線，其檢測最低限值可以達到9.5nM并且有很好的線性(r2>0.99) (圖2)。光譜掃描結果顯示在溶菌酶降解后其發射光波長峰值從350nm遷移到355.5nm并伴隨熒光強度的略微增強(圖3)。這一發射光波長峰值的遷移程度也十分接近預期值。
結論
SpectraMax iD3 讀板機可以通過測量色氨酸內源熒光對蛋白定性。利用15nm激發光和25nm發射光的帶寬，讀板機可以在低波長光譜范圍內檢測低濃度的色氨酸。另外，Spectral Optimization Wizard可以自動識別最優化的激發光和發射光波長。利用SoftMax Pro 軟件預先設定的程序，研究人員可以自動檢測溶菌酶降解前后的波長峰值及其遷移，從而節省了大量用于數據分析的時間。