第十章測序技術
在分子生物學研究中，DNA
的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger 等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam
和Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生A，T，C，G
四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE 膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA 序列。目前Sanger
測序法得到了廣泛的應用。Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA
聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP
缺乏延伸所需要的3-OH 基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T 或C 處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs
和ddNTPs
的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
第一節非同位素銀染測序系統操作技術
一、概述：
Promega
公司的SILVER SEQUENCETM DNA
測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90
分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM 系統用未修飾的5'OH 寡聚核苷酸作為引物，
減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。Taq
DNA 聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA 聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾品，對于雙鏈DNA
模板有非常好的效果，具有高度的準確性，能產生均一的條帶，且背景低。SILVER SEQUENCETM
系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP 可清除由GC
豐富區域所引起的條帶壓縮現象。退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR
產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始于每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC
含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer 的GC 含量約為50%的引物可得到最佳結果。由于本系統采用熱循環裝置,
與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA
產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03--2pmol 模板DNA, 隨模板種類而定。(2).
在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環也有助于消除由于線性dsDNA 模板(如PCR
反應產物)快速重退火所引起的問題。(3).高溫聚合酶反應減弱了DNA 模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
二、材料待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。
三、設備高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR 儀。
四、試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA 測序試劑盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺W/V)：95g丙烯酰胺，5g 甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm 過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2 周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g 過硫酸銨溶于4ml 水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE
緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g
Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ?2H2O，溶于雙蒸水中定容至1 升，置于4℃下可貯存2 周，其pH 約為8.3。
（5）TBE 電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE 備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2 升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2 克，甲醛3ml，溶于2 升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60 克碳酸鈉（Na2CO3)溶于2 升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
五、操作步驟：
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA
模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，并且注意如下幾點：
（1） DNA 的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA 一起電泳。
（2） 分光光度法對于很多DNA 提取物包括質粒小量制備來說，并不能給出一個可信的DNA 濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm 光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA 濃度。
（3） DNA 制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳后DNA 樣品的前面，并不能觀察到，但它們仍會有260nm 光吸收。
（一）測序反應：
1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf 管(G、A、T、C)。每管加入2ml 適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1 滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。
2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf 管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液5ml
引物4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液5ml
pUC/M13 正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2 步)中加入1.0ml 測序級Taq DNA 聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3 步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml 加入每一個d/ddNTP 混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf 管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350 堿基的長度。
7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA 測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA 的量一般按下面要求加入：模板種類/長度模板量
200bp (PCR 產物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋質粒產生的信號比松馳的線性雙鏈DNA 弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol 相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n 為引物堿基數
計算與1pmol 相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n 為模板堿基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n 為模板堿基數
3、為阻止Taq DNA 聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1 開始。
模式1：適用于引物<24 堿基或GC 含量<50%
95℃ 2 分鐘。然后： 95℃ 30 秒(變性), 42℃ 30 秒(退火), 70℃ 1 分鐘(延伸)。
模式2:適用于≥24 堿基或略短的GC 含量≥50%的引物。
95℃ 2 分鐘, 然后: 95℃ 30 秒(變性), 70℃ 30 秒(退火/延伸)。4. 在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過夜。
（二）、測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml 粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。
B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經自然干燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。
C. 4-5 分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程,每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。
2. 準備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。
(2)、長玻璃板的處理
A. 用浸透Sigmacote 溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
B. 5-10 分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote 溶液。
[注意]
1. 用過的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH 浸泡后除去。為防止交叉污染,
用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote 處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm 或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis
和10×TBE 緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，并用0.45mm
的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED
和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6 分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的TEMED 和過硫酸銨。
凝膠終濃度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE 緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。