蛋白激酶的分析是使用標記的供體底物，當酶樣品中含有磷酸轉移酶活性時，蛋白 質或多肽受體底物中標記物的積累就很容易被檢出。
| 實驗方法原理 | 鹽酸胍或脲都能使蛋白質變性，選用哪一種取決于不同的激酶，但一般首選鹽酸胍，因為對大多數激酶而言它的變性效果更好。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 2-丙醇Tris?Cl鹽酸胍脲DTTTween 20匹配的激酶反應緩沖液Mg／ATP 溶液[γ-32P] ATP三氯乙酸（TCA）焦磷酸鈉 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 按適當百分比濃度制備聚丙烯酰胺分離膠，加入 10 mg/ml 激酶底物，使其在分離膠混合液中的終濃度達到 1 mg/ml。均勻混合后澆入制膠裝置使其聚合。 2. 按通常的方法制備有激酶活性樣品的 SDS-PAGE 電泳樣品，電泳。 3. 電泳完畢后將膠放入 200 ml 20 %（V/V）2-丙醇/ 50 mmol/L Tris?Cl，pH 8.0 的洗液中，漂洗 20 min， 換入新的緩沖液，再重復 2 次。 4. 用 200 ml 的 1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris ? Cl pH 8.0 洗 3 次，每次 20 min。 5. 用 250 ml 的 6 mol/L 鹽酸胍 /1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris ? Cl pH 8. 0 或 8 mol/L 脲/1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris ? Cl pH 8.0 洗 2 次，每次 30 min。 6. 在 18 h 以上的周期內用 250 ml 的 1 mmol/L DTT/0.05 %（V/V）Tween 20/50 mmol/L Tris?Cl（pH 8.0）的溶液，4℃， 洗 8～10 次，使蛋白質充分復性。 7. 將膠放入 250 ml 與激酶匹配的反應緩沖液中（含 10 mmol/L MgCl2），30℃，溫浴 20 min。 8. 移走所有殘存緩沖液，將膠放入帶有密封蓋的容器或可熱密封的聚乙烯袋（容器應為放射性物質專用）。加入盡量少的激酶反應緩沖液，以正好覆蓋膠面為準。加 1/4 反應緩沖液容積的 10 mmol/L Mg/ATP 溶液（終濃度 50 μmol/L ATP），最后加入 20 μCi/ml [γ-32P] ATP。 9. 30℃，溫浴 1 h。 10. 在 250 ml 的 5 % TCA 中將膠浸泡 15 min，重復一次。在 500 ml 1 % 焦磷酸鈉/ 5 % TCA 中洗膠，重復洗滌，直至洗液幾乎不含放射性物質。 11. 在濾紙上使膠干燥，放射自顯影。 |
| 注意事項 | 因為樣品具有放射性，在樣品制備和轉移過程中應多加小心。相關的反應和操作應在帶有螺旋蓋的微量離心管中進行，以減少 32P 的放射性污染危害。在電泳時，必須待染料轉移出膠后方可進行下一步操作，因為這樣可使殘留的 [γ-32P] ATP 伴隨染料從膠中轉移出去，這也意味著在電泳緩沖液中含有 32P，因此應將其按放射性廢液的安全處理原則妥善處理。 |
| 其他 | 材料： 10 mmol/L 激酶底物，如髓鞘堿性蛋白 有激酶活性的酶樣品（見用于激酶分析的細胞裂解實驗），保持冰浴 試劑： 20%（V/V）2-丙醇／50 mmol/L Tris ? Cl（室溫下 pH 8.0） 1 mmol/L DTT / 50 mmol/L Tris ? Cl（室溫下 pH 8. 0） 6 mol/L 鹽酸胍/ 1 mmol/L DTT / 50 mmol/L Tris ? Cl（室溫下 pH 8.0）或 8mol/L 脲/1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris ? Cl（室溫下 pH 8.0） 1 mmol/L DTT/0. 05%（V/V）Tween 20 /50 mmol/L Tris ? Cl（4℃，pH 8.0） 匹配的激酶反應緩沖液 10 mmol/L Mg/ATP 溶液 10 mCi/ml [γ-32P] ATP（3000 Ci/mmol； Amersham， DuPont NEN 或 ICN Biomedicals） 5%（m/V）三氯乙酸（TCA） 1 %（m/V）焦磷酸鈉 /5%（m/V）TCA |