1．致敏抗原劑量的確定一般而言，在一定的范圍內，抗原的濃度與試驗的敏感性呈正比，超過這個范圍，再增加抗原，敏感性不會再提高，而且過大，有時會引起非特異性凝集。當采用一種新的抗原時，必須經過試驗，選擇適當的抗原致敏濃度，即把抗原稀釋成幾個不同的濃度分別致敏紅血球。再用這些致敏紅血球分別與標準陽性血清進行試驗，與標準陽性血清呈最高滴度的陽性反應的最小抗原劑量，即為該抗原的單位計量。致敏時，根據不同的抗原，可采用2～4個單位計量進行致敏。
2．致敏方法各種抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白質的致敏方法如下：
所需濃度的抗原1份
pH6.4PBS液4份
2.50%的鞣化紅血球懸液1份
混勻，置37℃水浴30min，離心，沉淀后，以2.5%兔血清生理鹽水洗滌1次，懸浮于1份兔血清生理鹽水中。
3．影響紅血球致敏的因素
⑴要有高純度或高效價的抗原或抗體。
⑵被致敏抗原或抗體的適當劑量和濃度。如抗體一般以μg/ml IgG為宜。抗豬瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗豬水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗豬肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗豬弓形體20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。
⑶pH：除雞卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使紅血球發生自凝。
⑷致敏溫度：一般為37℃，范圍是20℃～40℃。
⑸致敏時間：一般采用30min為最適時間，具有良好的特異性和重復性。也有采用60min。時間過長，會造成紅血球的形態不整，反應結果紊亂等。
⑹血球濃度：一般為1%，范圍為0.5%～1.5%。