鑒定方法有：
①血清維生素B12的測定是最直接的鑒定方法。血清維生素B12的濃度低于100μμg/ml，即可診斷為維生素B12缺乏（正常值為100～300μμg/ml）。
②尿中甲基丙二酸的測定是間接的方法，維生素B12缺乏時，由于特殊的代謝障礙，尿中甲基丙二酸的排出量增多，但是葉酸缺乏時并不增加，故可用來區分維生素B12缺乏和葉酸缺乏。
③維生素B12吸收試驗。以放射性鈷為標記的維生素B12 2.0μg給受試者口服，同時肌肉注射維生素B12 1000μg，然后測定48小時內尿的放射性。維生素B12吸收正常者，48小時能排出口服放射性鈷的5～40%；維生素B12吸收有缺陷者（如惡性貧血、胃切除后、熱帶營養性巨幼細胞性貧血時）則只有5%以下。
④治療性試驗，是臨床工作中最早采用、最簡單方便的一種診斷手段，在不具備開展上述各種檢查的條件時，可采用此法。用維生素B12治療后網組織紅細胞上升，同時，骨髓中巨幼紅細胞轉變成正常形態的紅系細胞，即可判斷為維生素B12缺乏。