1、實驗室檢查：
做血常規，肝、腎功能，尿液分析，骨髓穿刺等化驗檢查。頭頸部病變要做腦脊液化驗。兒童橫紋肌肉瘤尚無特異性血漿或尿標記物。
免疫組織化學可利用針對骨骼肌以及生肌蛋白的抗體來顯示腫瘤中橫紋肌成分。antidesmin、多特異性肌動蛋白(multispecific actin)、肌紅蛋白D(myoglobin D，MyoD)都是最敏感的標記物。vimentin、肌紅蛋白、dystrophin、cytokeratin、肌酸激酶(creatine kinase)M和B、S100和神經特異性烯醇化酶用來做進一步的鑒別診斷之用。肌紅蛋白D的表達在生肌前體轉換為肌肉細胞中有重要意義，而在橫紋肌肉瘤中這一過程是受到抑制的。
通過反轉錄聚合酶鏈反應(PCR)和熒光原位雜交技術，橫紋肌肉瘤的診斷可達到分子遺傳學水平，并對治療有指導意義。在腺泡型橫紋肌肉瘤中發現2、13q35-q14基因位點中斷，而在胚胎型橫紋肌肉瘤中發現11號染色體上有腫瘤生長抑制基因。
脫氧核糖核酸(DNA)含量(或稱倍體)也具有一定的診斷價值。Shapiro研究表明胚胎型均為高倍體，腺泡型主要為近四倍體。37個無法手術切除的橫紋肌肉瘤，8個二倍體的患兒全部死亡，而12個高倍體腫瘤中的10人存活(P＜0.0001)，但結果缺乏進一步證明。
因為上述生物學、免疫學和細胞學診斷方法在預后判斷以及治療上的重要指導作用，外科醫生必須獲得足夠多的腫瘤送檢，以確保診斷的正確。
2、其他輔助檢查：
CT、MRI可以定位腫物和其向周圍侵襲的情況。骨掃描可發現骨病變，CT可見肝、腦、心和肺轉移與否，頭頸部病變要做CT或MRI檢查，同時做腦脊液化驗。脊柱旁腫瘤可用MRI觀察脊髓浸潤情況。