真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5’端帽子結構(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。這種結構為真核mRNA的提取,提供了極為方便的選擇性標志,寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。mRNA的分離方法較多,其中以寡聚(dT)-纖維素柱層析法最為有效,已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特點,在RNA流經寡聚(dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液的作用下,mRNA被特異地結合在柱上,當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下,mRNA被洗脫,經過兩次寡聚(dT)纖維柱后,即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA
試劑準備
1.3M醋酸鈉(pH 5.2)
2.0.1M NaOH
3.1×上樣緩沖液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,經高壓消毒后按各成分確切含量,經混合后再高壓消毒,冷卻至65℃時,加入經65℃溫育(30min)的10%SLS至終濃度為0.1%。
4.洗脫緩沖液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS
5.無水乙醇、70%乙醇 6.DEPC