免疫沉淀實驗——制備抗體Sepharose偶聯物

蛋白質

NaClNa2CO3乙腈溴化腈甘氨酸

透析管濾紙

1.  1 ~30 mg/ml 的抗體在 4℃對 0.1 mol/l NaHCO₃ / 0.5 mol/l NaCl透析 24 h，期間換液3次。透析液的體積應500倍于抗體溶液。

2.  于4℃10 000 g 離心1 h，除去聚集體。

3.  取小份上清測A₂₈₀確定抗體的濃度。用0.1 mol/l NaHCO₃ / 0.5 mol/l NaCl稀釋抗體至5 mg/ml，于4℃保存。測此溶液的A₂₈₀。

4.  讓漿狀的Sepharose在燒杯中沉降，吸出并棄上清。稱出與抗體溶液體積相等的Sepharose。

5.  用Whatman 1號濾紙、布氏漏斗、Erlenmeyer三角抽濾瓶并將之連接到水泵上組裝 一套過濾裝置，以10倍體積的水洗Sepharose

6.  將Sepharose移至50 ml 燒杯，加入等體積的0.2 mol/l Na₂CO₃。

7.  在室溫按每100 ml Sepharose加3.2 ml CNBr/乙腈的量活化Sepharose。在磁力攪拌器輕柔攪拌下，慢慢用巴斯德吸管滴加CNBr，時間在1 min 以上，然后繼續輕柔攪拌5 min。

8.  按步驟5快速過濾Sepharose，抽氣至半干狀（即抽至成塊狀的Sepharose干裂，并失去光澤）。

9.  用10倍體積的冰冷1 mmol/l HCl洗滌，接著以2倍體積的0.1 mmol/l HCl洗。

10.  以足夠的冰冷0.1 mmol/l HCl讓Sepharose復水，使之重新恢復光澤，但液體不要超出其表面。

11.  立即將稱量好的Sepharose移至一燒杯，加入溶解于0.1 mol/l NaHCO₃ / 0.5 mol/l NaCl中的等體積抗體溶液。用磁力攪拌器室溫攪拌2 h 或4℃過夜。

12.  加入50 mmol/l 的pH8.0的甘氨酸（或乙醇胺）溶液，以飽和Sepharose上的剩余活性基團，并讓膠漿沉降。吸出部分上清，離心去殘余Sepharose后，測其A₂₈₀，并與步驟2測出的抗體溶液的濃度比校，以確定偶聯效率。

13.  抗體-Sepharose保存于TSA溶液。