克隆串聯體實驗

溶液與緩沖液 LoTE cDNA標簽 連接酶

試劑盒 PCR儀

一、在pZero的I位點連接串聯體

1.SphI酶切載體，與按大小回收的串聯體片段連接；我們推薦在pZero的Sph1位點上克隆串聯體，有關于在此載體上克隆的細節我們參考了Zero Background 克隆試劑盒的使用手冊：

2.在16℃ 下孵育過夜。

3.以LoTE擴增體積到200ul。

4.等體積的PCI進行抽提（實驗方案A, 第2步)。

5.入下列物質沉淀水相：

6.4°C 下，在微離心機中以13000r/min離心15 min。

7.沖洗沉淀物4次（！！！），然后瞭干。

8.重懸于4ul 的 LoTE中。

9.用1ul連接混合物來轉化ELECTROMAXDHlOB 細胞。

二、電穿孔

可應用任何轉化方法，我們推薦使用電穿孔法是由于它與感受態ELECrR0MAXDHlOB 細胞結合轉化效率很高（>10¹⁰ 轉化體/ug 質粒)。

1.在冰上融化 100ul的 ELECTROMAX DH10B細胞。

2.同時在冰上冷卻所需數量的電穿孔小杯。

3.融化后，立即對 ELECTROMAXDH10B細胞進行下一步操作，將其分為每份 35ul（冰上操作)。

4.向 35ul—份的細胞中加入 ImI 的連接產物，輕叩試管使其混合。

5.移入冷卻好了的小杯中，將細胞移至小杯的電極間，然后保存于冰上。

6.用下述設置在 GenePulserD 上電穿孔：

7.應用這個脈沖后，立即加入 965ulSOC 介質。

8.在 37°C下孵育 Ih。

9.含有抗生素 Zeocin 的LB 板上用 50ul 或 IOOul 鋪板。

注意：有關板和 SOC 介質的詳細情況在 ZeroBackground克隆試劑盒的使用手冊中有詳盡描述。

10.37°C 的恒溫箱內將鋪好的板過夜孵育。

11.第二天這些板上應含有數百個克隆。