實驗方法原理 制備特異性的單鏈 RNA 探針不僅比 DNA 探針更容易，在雜交反應中一般也比具相同比活性的 DNA 探針產生更強的信號，這可能是由于含有 RNA 的雜合鏈固有的更高穩定性的緣故（Casey and Davidson 1977)。雖然 DNA 探針仍普遍地應用于 Northern 和 Southern 雜交，但當分析哺乳動物基因的轉錄時，放射性標記的 RNA 目前是首選探針。由于 RNA 酶 A 既耐用又容易控制，可用 RNA 酶 A 來消化 RNA-RNA 雜合體，而不必用特異性 S1 核酸酶來消化 DNA-RNA 雜合分子，RNA 酶 A 可在較寬的濃度范圍內使用而不影響實驗結果（Zirmetal. 1983; Mehonetal. 1984)。
實驗材料 限制性內切核酸酶RNA 聚合酶胰腺 DNA 酶Ⅰ模板 DNA
試劑、試劑盒 乙酸銨牛血清白蛋白DTT乙醇酚氯仿胎盤 RNA 酶抑制劑醋酸鈉轉錄緩沖液rNTP 溶液
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠微量離心管Sephadex G-50 離心柱水浴
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
乙酸銨（10 mol/L）
牛血清白蛋白（2 mg/ml，組分 V，Sigma 公司）
DTT ( 1 mol/L)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盤 RNA 酶抑制劑（20 單位/μl）
醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)
10X 轉錄緩沖液（400 mmol/L Tris-Cl ( 37℃ 下 pH 7.5)，60 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 鹽酸亞精胺（spermidine HCl )，50 mmol/L NaCl）
2. 酶與緩沖液
適當的限制性內切核酸酶
T3、T7 或 SP6 噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶
無 RNA 酶的胰腺 DNA 酶Ⅰ (1 mg/ml)
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.8%~1.0%)
4. 核酸與寡核苷酸
含 rATP、rCTP、和 rUTP 各 5 mmol/L 的 rNTP 溶液
rGTP ( 0.5 mmol/L)
模板 DNA
5. 放射性復合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 400~3000 Ci/mmol）
6. 專用設備
微量離心管（0.5 ml)
Sephadex G-50 離心柱，用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)平衡
預熱至 40℃ 的水浴
二、方法
1. 用適當的限制酶消化超螺旋質粒 DNA 制備 5 pmol 的線性模板 DNA。取一小份消化的 DNA (100 ng) 進行瓊脂糖凝膠電泳分析。如有必要，再補加限制酶繼續溫育，直至不再殘存痕量的未消化 DNA。
2. 如必須用產生 3' 突出端的限制酶如 PstI 或 SstI，則應用噬菌體 T4 DNA 聚合酶在四種 dNTP 的存在下處理消化的 DNA 片段，以除去產生的 3' 突出端。
3. 用酚: 氯仿抽提及用標準乙醇沉淀純化模板 DNA。將 DNA 溶解于水，使其終濃度為 100 nmol/L ( 如 3kb 質粒為 200 μg/ml)。
4. 將下列前六種組分溫育至室溫，在一個滅菌的 0.5 ml 微量離心管中，室溫下以下列順序混合：
模板 DNA 0.2 pmol（3 kb 質粒為 400 ng）
無 RNA 酶的水 加至 6 μl
5 mmol/L rNTP 濃液 2 μl
100 mmol/L DTT 2 μl
10X 轉錄緩沖液 2 μl
2 mg/ml 牛血清白蛋白 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] rGTP 5 μl
( 比活性 400~3000 Ci/mmol)
輕彈管外壁以使各組分混合。然后加入：
胎盤 RNA 酶抑制劑（10 單位） 1 μl
噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶（約 10 單位) 1 μl
輕敲管壁外側使反應物混合，離心 1~2s 以使所有液體沉降到管底。37℃（T3 和 T7 噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶）或 40℃（SP6 噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶）下溫育反應物 1~2 h。
5. ( 任選）如需全長轉錄物，可加入 2 μl 0.5 mmol/L rGTP，在適宜該聚合酶的溫度下再溫育 60 min。
6. 加入 1 μl 1 mg/ml 無 RNA 酶的胰 DNA 酶 I 以終止體外轉錄反應。輕彈管外壁以混合各試劑。37℃ 溫育反應混合物 15 min。
7. 加入 100 μl 無 RNA 酶的水，通過用酚: 氯仿抽提純化 RNA。
8. 將水相轉移至一個新的微量離心管，用下列三種方法中的任一方法將放射性標記的 RNA 與不需要的小分子 RNA 和 rNTP 分開：
(1) 用乙醇沉淀純化 RNA
① 在水相中加入 30 μl 10 mol/L 醋酸銨，混勻后再加入 250 μl 用冰預冷的乙醇。置 于冰上 30 min 后，在微量離心機中 4℃ 下以最大速度離心 10 min 收集 RNA。
② 小心地盡量吸去其中的乙醇，然后將管子敞開口，放置于實驗臺上數分鐘，使剩余的可見的乙醇揮發干凈。把 RNA 重溶于 100 μl 無 RNA 酶的水中。
③ 加 2 倍體積冰預冷的乙醇至小管內，將 DNA 貯存于 -70℃ 備用。
(2) 通過離心柱層析純化 RNA
① 將 Sephadex G-50 離心柱平衡于 10 mmol/L Tris-Cl 中（pH 7.5) 滅菌處理。
② 用離心柱層析純化 RNA。
③ 將洗脫的 RNA 貯存于 -70℃ 以備用。
(3) 通過凝膠電泳純化 RNA
① 準備中性聚丙烯酰胺凝膠。
② 在水相中加入適當的凝膠上樣緩沖液，通過凝膠電泳純化 RNA。
③ 通過放射性自顯影定位 RNA。
④ 用擠碎和浸泡的方法從凝膠塊中純化 RNA。
⑤ 將 RNA 貯存于 -70℃ 備用。