酸堿催化是指酶通過瞬時向底物提供質子或接受質子，從而穩定過渡態，加速反應。根據不同的酸堿理論，可分為一般酸堿（廣義酸堿）催化和特殊酸堿（狹義酸堿）催化兩種，后者特指H+和OH-的催化作用；前者還包括其他弱酸弱堿的催化作用。酶促反應一般發生在近中性條件，H+和OH-的濃度很低，所以主要是一般酸堿催化。酶分子中的一些可解離集團如咪唑基、羧基、氨基、巰基常起一般酸堿催化作用，其中咪唑最活潑有效。
酶經常通過酸堿共催化和質子轉移通路來加速反應。這種效應可以用四甲基葡萄糖在苯中的變旋反應作為參考。此反應如果單獨用吡啶（堿）或酚（酸）來催化，速度很慢；如果二者混合催化，則速度加快，即酸堿共催化。如果把酸和堿集中在一個分子中，即合成α－羥基吡啶，它的催化速度又加快7000倍。這是因為兩個催化集團集中在一個分子中有利于質子的傳遞。在酶－底物復合物中經常由氫鍵和共軛結構形成質子傳遞通路，從而大大提高催化效率。