分光光度計的基本原理是建立在光與物質相互作用的基礎上,當光子和某一溶液中吸收輻射的物質分子相碰撞時,就發生吸收,測量其吸光度值的大小可反映某種物質存在的量的多少。光的吸收程度與濃度有一定的比例關系,這就是著名的比直定律。該定律成立的必要條件是單色光(單一波長光)照射樣品。
為了使該定律具有良好的線性,對測量濃度有一定的范圍要求。也就是吸光度值控制在0.2～0.7之間,并且要求單色光垂直照射樣品,試樣要均勻。一臺性能優良的分光光度計,必須有一個高性能的光路系統即單色儀。單色儀有兩類:一類是以玻璃三棱鏡為色散元件組成;另一類是由光柵為色散元件組成。兩種單色儀各有利弊,用石英玻璃做成的單色儀,在紫外光區有較高的色散率,波長精度較高,分辨率可達0.2nm,但在可見光區要大于2nm,波長精度不線性,像751G型分光光度計,是由光柵做成的單色儀,在全段波長(200nm～800nm)之間具有相同的波長精度。但目前大部分光柵或分光光度計所用的光柵都是復制光柵,波長精度不太高,如754、722、752型分光光度計,波長精度在±2nm。
紫外分光光度計的工作波長在200～1000nm之間，其波長范圍涵蓋紫外光（200～400nm）、可見光（400～750nm）及近紅外光（750～1000nm）。在紫外光區（200～350nm）測定時必須用石英杯。