人血清、血漿及相關液體樣本6酮前列腺素(6KPG)含量測定

實驗概要

本實驗采用雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)。將標準品、待測樣本加入到預先包被人6酮前列腺素(6-K-PG)單克隆抗體透明酶標包被板中，溫育足夠時間后，洗滌除去未結合的成分，再加入酶標工作液，溫育足夠時間后，洗滌除去未結合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉化為藍色產物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中人6酮前列腺素(6-K-PG)濃度呈正相關，450nm波長下測定OD值，根據標準品和樣品的OD值，計算樣本中人6酮前列腺素(6-K-PG)含量。

主要試劑

1. 人6酮前列腺素(6-K-PG)定量檢測試劑盒(ELISA)

2. 蒸餾水

主要設備

1. 37℃恒溫箱

2. 標準規格酶標儀

3. 精密移液器及一次性吸頭

4. 一次性試管

5. 吸水紙

實驗步驟

1. 準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30分鐘。

2. 配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3. 加標準品和待測樣本：取足夠數量的酶標包被板，固定于框架上，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5倍)；空白對照孔不加。

4. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。

6. 加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。

7. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

8. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s(或用手輕輕震蕩混勻30s)，37℃避光顯色15min。

10. 終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應(顏色由藍色立轉黃色)。

11. 測定：以空白孔調零，在終止后15分鐘內，用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。

12. 計算：根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來計算。最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。

注意事項

1. 樣本不能含疊氮鈉(NaN3)，因為疊氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑。

2. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

3. 樣本應充分離心，不得有溶血及顆粒。

4. 實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

5. 酶標包被板開封后如未用完，應立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

6. 建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。

7. 牢記樣本已經稀釋5倍，計算結果乘以5才是樣本實際濃度。

8. 本試劑盒定量范圍為3.75-120pg/mL，超過此范圍，為標準曲線延伸計算所得，不做為準確定量結果，請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結果(3.75-120pg/mL范圍內)，乘以總稀釋倍數即為樣本最終濃度。

9. 若顯色過淺，可適當延長底物溫育時間。

10. 為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復使用封板膜。

11. 試劑盒保質期內使用，不同批號的試劑不得混用。

12. 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。